基于Cell-SELEX的生物标志物发现方法学研究

Biomarkers are indispensable not only for biomedical research but also for diagnosis and therapy; and are the essential tool for precision medicine. Currently, the approaches for biomarker discovery cannot generate enough biomarkers for the biomedical research and clinical practice. New methods for biomarker discovery are highly necessary. Recently, Cell-SELEX has shown good promise in biomarker discovery, which is based on the selection of aptamers specific for diseased cells, identification of the molecular targets of aptamers and then validation of the molecular targets as biomarkers. However, due to the critical bottlenecks lies in Cell-SELEX and the purification and identification of aptamer targets，the Cell-SELEX based biomarker discovery is in the early stage; no complete study has been made yet. Our proposal is based on our long-term basic research in Cell-SELEX and a series of aptamers specific for cancer cells that we have gotten. We will develop a platform for biomarker discovery based on Cell-SELEX by establishing universal methods for purification and identification of different types of aptamer targets; developing detection and validation methods for biomarkers. We will explore methods for cancer classification and diagnosis by biomarker expression profiles probed by a group of aptamers. Through the completion of the proposed work, we will establish a complete a complete set of methods for Cell-SELEX based biomarker discovery, promote the practical application of aptamers generated from cancer cells. Furthermore, we will provide novel biomarkers and biomarker panels.

生物标志物是现代生物医学研究和疾病诊治的必备工具，是实现精准医疗的基础。目前发现生物标志物方法不能满足科研与临床的需要，迫切需要新方法。近年提出的基于Cell-SELEX的标志物发现新方法具有较好前景，即通过Cell-SELEX筛选病变细胞特异性适配体，再以适配体捕获并鉴别其靶标分子而发现标志物。但由于Cell-SELEX和适配体靶标鉴别的难度较大，该方法尚处于早期研究阶段，还没有开展完整的方法学研究。本申请基于我们在Cell-SELEX方面长期的积累，拟以系列肿瘤特异性的适配体为对象，发展标准化的针对不同类型靶标的纯化/鉴定方法、生物标志物的检测与验证方法，建立基于Cell-SELEX的标志物发现平台；探索基于生物标志物组表达谱的肿瘤分类和分子诊断方法。通过这些研究完善基于Cell-SELEX的标志物发现新方法，推动适配体的广泛应用，为生物标志物的发现和疾病的分子诊断提供新的方法。

生物标志物是现代生物医学研究、疾病分子诊断和精准治疗的基础。现有的生物标志物远远不能满足临床诊治的需要，发展新的生物标志物发现方法，寻找有价值的生物标志物对生物医学研究和医疗水平的提高具有重要意义。本项目着眼于发展和完善“基于Cell-SELEX的生物标志物发现”的方法学研究；筛选新的核酸适配体；发现潜在疾病标志物；发展基于核酸适配体的生物标志物检测方法和试剂；针对基于Cell-SELEX的生物标志物发现中的技术瓶颈问题——细胞特异性核酸适配体分子靶标的分离、纯化与鉴定，开展方法学基础研究。经过五年的研究，我们建立了高效的基于Cell-SELEX的生物标志物发现的技术平台；分别筛选得到了特异性识别乳腺癌、结直肠癌、分化的神经母细胞瘤、耐药卵巢癌、口腔癌、膀胱癌等系列细胞系的核酸适配体，并对它们进行了结构优化与功能表征；以不同适配体为配基，通过甲醛原位交联、磁球分离、定量蛋白质组学技术等分离鉴定了它们的分子靶标，分别为：人转铁蛋白受体、碱性磷酸酶酶异源二聚体、神经细胞粘附分子L1(L1CAM)、肝细胞生长因子受体、整合素3、蛋白酪氨酸磷酸酶LAR、朊蛋白和锌转运蛋白ZIP10等；通过细胞、分子生物学技术初步验证了这些蛋白均与肿瘤的发生、发展和转移密切相关，可作为潜在的肿瘤标志物。研究了核酸适配体结构与功能、核酸适配体与靶标以及细胞的相互作用机制；发展了系列分子探针用于细胞和组织的分子成像，建立了选择素L、L1CAM、碱性磷酸酶酶异源二聚体等潜在生物标志物蛋白的检测方法；建立了循环肿瘤物质的分离与检测新方法，并用临床血液样本验证了该方法用于结直肠癌诊断的可行性。发展了系列的痕量蛋白质分离材料和酶反应器；建立了系统的脂质组学分析方法；发展了二次离子质谱和MAILDI-TOF质谱用于细胞和组织原位成像的方法；结合蛋白质组学和分子生物学技术阐明了铂类抗肿瘤药物与核酸、蛋白质的作用机理。这些研究为新的疾病标志物的发现，新的诊疗产品的开发提供了技术、方法和材料。