氧化低密度脂蛋白通过DNMT3b调控调节性T细胞FOXP3基因甲基化修饰的机制研究

Oxidized low-density lipoprotein (OxLDL) plays a crucial role in the initiation and progression of atherosclerosis. It has been noted that a stable FOXP3 expression is a prerequisite for the maintenance of the development and suppressive properties of Tregs. Demethylation of DNA encoding the transcription factor FOXP3 was found to be essential for the stable maintenance of the suppressive properties of Tregs. Demethylation analysis of the FOXP3-Treg-specific demethylated region has been regarded as a marker for Tregs. Our preliminary study first demonstrated that the expression of DNMT3b and methylation level of the FOXP3 gene were increased in CD4+CD25+ regulatory T cells in CHD patients. It has been observed that Ox-LDL can up-regulated ROS level via LOX-1-mediated. Furthermore, ROS-induced activation of Akt increased DNMT3b expression. It is unclear whether Ox-LDL up-regulated DNMT3b protein level via LOX-1-ROS-AKT signaling pathway，subsequently resulting in reduced demethylation level of the FOXP3 gene and FOXP3 expression in Treg cells. Based on our previous data, we proposed confirming the regulatory role of DNMT3b in aberrant methylation of the FOXP3 gene in Tregs and further demonstrate that Ox-LDL up-regulated DNMT3b protein level via LOX-1-ROS-AKT signaling pathway in Tregs. This study is helpful to further demonstrate the epigenetic mechanism of Ox-LDL promoting atherosclerosis, and to provide innovative strategy for clinical treatment.

氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)在动脉粥样硬化（AS）的发生和发展中起到非常重要的作用。FOXP3的去甲基化状态决定FOXP3的稳定表达，是Treg维持表型和发挥功能所必须。DNA甲基化修饰是由甲基转移酶（DNMTs）介导的。本课题前期研究发现，冠心病患者外周血Treg中DNMT3b表达明显增高。体外Ox-LDL干预下，Treg中DNMT3b表达明显增加，FOXP3去甲基化水平降低（甲基化水平升高）。研究发现Ox-LDL可作用于LOX-1受体，激活ROS，而ROS-AKT通路活化可引起DNMT3b表达增加。本研究拟在已有的工作基础上，研究氧化低密度脂蛋白通过DNMT3b调控Treg FOXP3基因甲基化修饰的机制。本研究有助于进一步阐明Ox-LDL促进动脉粥样硬化的表观遗传学相关机制。DNA甲基化异常的致病过程是可以被逆转的，这可能是未来治疗的靶点。

目的：氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)在动脉粥样硬化（AS）的发生和发展中起到非常重要的作用。FOXP3的去甲基化状态决定FOXP3的稳定表达，是Treg维持表型和发挥功能所必须。DNA甲基化修饰是由甲基转移酶（DNMTs）介导的。前期研究发现，体外Ox-LDL干预下，Treg中DNMT3b表达明显增加，FOXP3去甲基化水平降低（甲基化水平升高）。本研究拟研究Ox-LDL是否是通过DNMT3b调控Treg FOXP3基因甲基化修饰的机制，进而促进动脉粥样硬化。方法：本研究通过构建DNMT3b慢病毒干扰APOE-/-基因敲除小鼠，观察DNMT3b 基因敲低后，小鼠外周血Treg 细胞水平以及 Treg 细胞中FOXP3-TSDR 的甲基化水平，FOXP3 的表达，血浆中相关炎症因子水平以及主动脉根部粥样硬化情况。同时，Ox-LDL 联合DNMT3b慢病毒干扰Treg，甲基转移酶抑制剂（AZA及EGCG）干预健康人外周血Treg 细胞。观察DNMT3b 被抑制后FOXP3-TSDR 的甲基化水平，FOXP3 的表达水平。结果：1.AZA及EGCG干预后可明显降低DNMT3b的mRNA及蛋白表达水平，进而使FOXP3甲基化水平降低 FOXP3的mRNA及蛋白水平升高，TGF-β及IL-10水平明显升高，IL-β及IFN-γ水平明显降低。使用DNMT3b慢病毒干扰后，效果更明显。DNMT3b的mRNA及蛋白表达水平降低，进而使FOXP3甲基化水平降低 FOXP3的mRNA及蛋白水平升高，TGF-β及IL-10水平明显升高，IL-β及IFN-γ水平明显降低。2.在高脂饮食喂养APOE-/-基因敲除小鼠的基础上，行DNMT3b慢病毒干扰。发现与12周高脂饮食组相比，12周高脂饮食基础上行DNMT3b慢病毒干扰组的DNMT3b的表达水平明显减低，FOXP3甲基化水平明显减低。FOXP3的表达水平明显升高。进而外周血Treg水平明显升高，小鼠血浆中TGF-β，IL-10水平明显升高，小鼠主动脉根部动脉粥样硬化明显减轻。延长小鼠高脂喂养周期，与18周高脂饮食组相比，18周高脂饮食基础上行DNMT3b慢病毒干扰的结果与12周一致。结论：OxLDL通过上调DNMT3b的表达，促进Treg中FOXP3基因甲基化水平，进而抑制FOXP3的表达，抑制Treg水平，促进动脉粥样硬化。