20S蛋白酶体亚基在脑心肌炎病毒复制和组装中的作用

The Encephalomyocarditis virus is a potential zoonotic agent. Host proteins are required for EMCV life cycle. Until now，few host proteins involved in EMCV replication and assembly were identified and the molecular mechanism of EMCV life cycle is unknown. Our previous studies showed that several subunits of 20S proteasome were incorporated into EMCV viron by using liquid chromatograph mass spectrometry method (LC-MS). These 20S proteasome subunits include PMSA1, PMSA5, PMSA6, PSMB2, PMSB4, PMSB5 and PMSB6. However, the functions of these subunits of 20S proteasome in EMCV infection, replication and assembly are unknown. In this project,(1)we will study the functional roles of 20S proteasome subunits in EMCV replication after the BHK-21 cells are treated with specific proteasome inhibitors. Meanwhile, EMCV replication and growth will be studied after knockdown or overexpression of these 20S proteasome subunits in BHK-21 cells.(2) We will investigate whether EMCV genomic RNA interacts with these 20S proteasome subunits by using RNA-pulldown to test whether EMCV genomic RNA is required for 20S proteasome subunits to assembly into EMCV virions. (3) We will identify the interactions between EMCV viral proteins and 20S proteasome subunits by using yeast two-hybrid (Y2H ) and Co-immunoprecipitation (Co-IP). 　　 Our work will enable us to understand the functional roles of the 20S proteasome in EMCV life cycle, which will be important for studying the pathogenesis of EMCV and designing new drugs or vaccines against EMCV infection in the future.

脑心肌炎病毒（EMCV）是一种重要的人畜共患病病原，该病毒利用宿主蛋白完成自我复制和组装，但宿主蛋白如何参与EMCV的复制和组装过程还不是很清楚。我们首次研究发现，20S蛋白酶体的多个亚基被包装入EMCV病毒粒子。目前，20S蛋白酶体及其亚基参与EMCV的生命周期的研究还没有报道。本项目将通过特异的蛋白酶体抑制剂抑制20S蛋白酶体的活性、过度表达或RNA干扰下调20S蛋白酶体亚基蛋白表达等方法研究20S蛋白酶体亚基对EMCV复制的影响。同时利用酵母双杂交、免疫共沉淀等方法筛选与20S蛋白酶体亚基相互作用的病毒蛋白，研究20S蛋白酶体亚基如何与EMCV基因组或编码蛋白相互作用，阐明其包装入病毒粒子的分子机制。本研究对阐明EMCV复制及病毒粒子组装机制具有重要意义，也为以后研究其它宿主蛋白在EMCV复制过程中的作用打下坚实基础。

宿主蛋白在病毒复制周期中的各个阶段都发挥着重要作用。有研究表明泛素-蛋白酶体在病毒的入胞、脱壳、蛋白翻译、基因组复制、病毒粒子组装以及释放过程中起重要作用。我们研究发现20S蛋白酶体亚基能够促进EMCV复制，这将为阐明EMCV的复制机理打下基础。EMCV属于小RNA病毒科病毒，有研究报道，小RNA病毒编码的蛋白酶可以通过切割免疫相关分子调节先天免疫。3C蛋白酶是EMCV编码的唯一蛋白酶。为了检测EMCV 3C蛋白酶能否切割先天免疫分子，我们在HEK293细胞中共表达3C蛋白酶以及Ⅰ型干扰素和NF-κB信号通路中的关键免疫蛋白，结果发现EMCV 3C蛋白酶能够特异性切割TANK。将3C蛋白酶的半胱氨酸酶活性位点：第46位组氨酸和第159位半胱氨酸突变以后，3C蛋白酶失去切割TANK的活性，说明3C蛋白酶切割TANK依赖于其蛋白酶活性。用MG132、Z-VAD、NH4Cl处理细胞后并不影响3C蛋白酶对TANK的切割作用，说明3C蛋白酶切割TANK并不依赖于泛素-蛋白酶体途径、细胞凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶活性、溶酶体途径。通过分析TANK切割产生的片段大小以及3C蛋白酶的底物特性对TANK进行点突变，结果发现将TANK第197位及291位谷氨酰胺残基突变以后产生的TANK突变体不能够被3C蛋白酶切割，表明3C切割TANK位于第197位及291位谷氨酰胺残基。切割后产生的N端片段能够稳定存在，C端片段及其中间体片段不稳定，可以通过泛素-蛋白酶体途径降解。在EMCV感染情况下，TANK只有第291位谷氨酰胺被切割，切割产生的C端片段不稳定，可以通过泛素-蛋白酶体途径降解。TRAF6是E3泛素连接酶，机体受到刺激后TRAF6能够泛素化，介导NF-κB信号通路的激活，TANK能够和TRAF6相互作用抑制TRAF6的泛素化。我们研究发现EMCV 3C蛋白酶切割TANK产生的TANK N端片段不能够抑制TRAF6介导的NF-κB启动子的激活以及p65的核转位，3C切割TANK也解除了TANK对TRAF6泛素化的抑制作用。综上，EMCV感染可以通过切割TANK，解除其对TRAF6泛素化的抑制作用而激活NF-κB信号通路。此研究首次报道了EMCV 3C蛋白酶对TANK的切割作用，这是EMCV调节先天免疫的一个新机制，为其他病毒调控先天免疫的研究以及EMCV的防控提供思路。