以分泌型PD-1阻断PD-1/PD-L信号通路提高SIV辅助调控蛋白免疫原性的研究

We have found that co-vaccination of SIV regulatory and accessory proteins with SIV structural proteins induced broad-spectrum and balanced immune response. The immunogenecity of regulatory and accessory proteins, however, was relatively low, especially when co-vaccinated with the structural proteins. Thereby, how to effectively improve their immunogenecity is an important and urgent scientific problem to be settled. Our previous results demonstrated that blocking the PD-1/PD-L inhibitory signaling pathway by using secreted PD-1 (sPD-1) harbored in a recombinant adenovirus vector (rAdV) significantly enhanced the capacity of SIV Gag to induce cellular immune response. In this project, we aim to advance our study to enhance the immunogenecity of SIV regulatory and accessory proteins through blockade of PD-1 signalling pathway with sPD-1. We have generated a series of rAdVs carrying different forms of sPD-1 expression cassette, and expect to select the most effective blockade strategy that can improve the immunogenecity of SIV regulatory and accessory proteins in the available mouse model. Meanwhile, the impact of PD-1 signaling pathway blockade on the capacity of antigen-specific T-cell proliferation and cytokine secretion will be addressed in vitro using mouse lymphocytes isolated from spleen, which will dissect the mechanism how PD-1 signaling pathway blockade can improve antigen immunogenicity. This study will provide important guidance for designing new HIV/SIV vaccine.

我们发现SIV辅助调控蛋白与结构蛋白联用作为疫苗抗原能够诱发广谱且均衡的免疫反应，但是辅助调控蛋白的免疫原性相对较低，尤其在与结构蛋白联用时更低。如何有效提高辅助调控蛋白的免疫原性是亟待解决的科学问题。利用携带分泌型PD-1（sPD-1）基因的腺病毒载体，我们已在小鼠模型上证实，以sPD-1竞争性阻断PD-1介导的免疫负调节信号通路后，Gag抗原可引发更强的细胞免疫反应。我们拟进一步采用该策略来提高辅助调控蛋白的免疫原性。我们将设计并构建一系列以不同方式携带sPD-1基因的腺病毒载体，在小鼠模型上筛选最能有效提高辅助调控蛋白免疫原性的策略；同时，我们将利用纯化的sPD-1蛋白，在小鼠脾淋巴细胞中研究信号通路阻断的免疫学效应，尤其是对抗原特异性T淋巴细胞增殖能力及细胞因子分泌能力的影响,从而揭示PD-1信号通路阻断提高抗原免疫原性的机制。本研究的结果将对于新型艾滋疫苗的设计有重要的参考价值。

诱导广谱且均衡的细胞免疫反应对新型HIV疫苗的设计至关重要。我们前期发现，SIV 辅助调控蛋白与结构蛋白联用能够诱发较为广谱的免疫反应，但是辅助调控蛋白的免疫原性相对较弱，尤其在与结构蛋白联用时更弱。在本研究中，我们构建了携带分泌型PD-1（sPD-1）及分泌型Tim-3（sTim-3）基因的腺病毒载体，并表达、纯化了sPD-1、sTim-3蛋白。我们发现，免疫过Ad5-SIV疫苗的小鼠脾脏淋巴细胞与sPD-1/sTim-3及抗原多肽共孵育，可分泌更多的IFN-γ、TNF-α，提示以sPD-1/sTim-3阻断PD-1/Tim-3介导的负调节信号通路可显著提升特异性T淋巴细胞分泌细胞因子的能力；更有意思的是，Ad5-SIV疫苗联合Ad5-sPD-1、Ad5-sTim-3可诱导更强的细胞免疫反应，针对结构蛋白与辅助调控蛋白的反应趋于均衡，而且免疫细胞分泌细胞因子的能力及增殖能力均显著提升，说明sPD-1、sTim-3可潜在的作为新型HIV疫苗的佐剂。同时，我们探索了一种将抗原靶向细胞自噬体以提升免疫原性的策略。我们以SIV Gag为模式抗原，与自噬相关基因LC3b融合，整合至质粒载体及Ad5载体。Gag-LC3b定位于细胞自噬体，显示LC3b可将融合抗原靶向于细胞自噬体；以质粒载体或Ad5载体疫苗免疫小鼠，发现Gag-LC3b可诱导更强的细胞免疫反应及抗体反应；CD4+T细胞反应的提升效果最为显著。因此，LC3b融合于SIV抗原可显著提升其免疫原性。我们还优化了融合抗原的构建策略。以结核杆菌Ag85A、Mtb32为模式抗原，我们发现密码子优化并以GSG连接可诱导更强的细胞免疫反应。进一步，我们建立了SIVmac239感染猕猴模型并评估了ART联合Ad5-SIV免疫治疗的效果，发现药物联合免疫治疗在部分猕猴中可降低病毒载量并延长病毒反弹时间，但是Ad5-SIV疫苗在猕猴中的免疫原性需要进一步提升。因此，通过本项目的研究，我们发现了sPD-1、sTim-3、LC3b等三种潜在的免疫佐剂，可大大提升疫苗的免疫原性；优化了融合抗原的构建策略，进一步提升多抗原疫苗的免疫原性；建立了SIVmac239感染猕猴模型并检测了Ad5-SIV疫苗的免疫治疗效果，为评估新型免疫佐剂及新型疫苗策略提供了大动物模型；这些成果为新型治疗性HIV疫苗的研究奠定基础。