构建可缓释VEGF的生物纳米复合支架修复腹壁缺损的实验研究

The lack of rapid vascularization after the implantation of biocomposite scaffold, which leads to insufficient host tissue incorporation and decreased mechanical strength of the defect site, may cause eventual recurrence of hernia in the long-term study. The development of nanotechnology promised to improve this unsolved problem. In this study, we will designe a multi-walled carbon nanotube (MWCNT)-porcine small intestinal submucosa (PSIS) composite scaffold which could sustainably release vascular endothelial growth factor165 (VEGF165). It is hypothesized that the uncontrolled burst release of VEGF from the carrier matrix can be avoided by surface functionalization of VEGF-loaded MWCNT, resulting in durative release of VEGF in vivo during the study periods. Afterward, the functionalized VEGF-loaded MWCNT is incorporated into PSIS to construct a unique composite scaffold with improved and novel characteristics.Then tenocytes will be seeded into the composite scaffold to promote the process of collagen development and abdominal wall defect construction. The objectives of this study are to evaluate the composite scaffold in terms of VEGF released; evaluate the bioactive properties, mechanical strength, and toxicity; and detect the roles of VEGF-loaded MWCNT and tenocytes in abdominal wall defects repairing.

作为常用的腹壁缺损修复生物材料，猪小肠粘膜下层（PSIS）是一种无免疫原性、完全可降解的三维脱细胞基质，其在植入缺损部位后存在由于组织内源性再生不足而导致缺损复发的风险。现有研究表明植入物的早期血管化和宿主细胞化有利于组织内源性再生。我们的前期研究发现碳纳米管（CNT）通过等离子体镀膜技术处理后可携带并缓释VEGF，将其与PSIS结合再植入缺损部位可加速PSIS的血管化；并且体外预植自体腱细胞的PSIS在体内具有显著诱导宿主细胞长入的作用。因此，我们推测通过构建可携带VEGF缓释装置与预植自体腱细胞的PSIS复合支架将能够显著改善腹壁缺损的修复效果。本课题拟将可缓释VEGF的CNT加载于胶原膜基质内，再嵌入两层预植自体腱细胞的PSIS间，构建一种可缓释VEGF的生物纳米复合支架，研究其促进新生血管和宿主细胞长入的效果与机制，研究结果将为腹壁缺损修复的生物材料学研究提供新的思路和理论指导。

本课题按计划完成了相应的实验任务。首先本研究对MWCNT进行纯化，纯化后的MWCNT通过溶液共混装载VEGF (1000:1)。将装载VEGF的MWCNT以不同浓度（1%wt、3%wt、5%wt、10%wt）复合到PSIS上，构建可缓释VEGF的复合支架。检测其细胞毒性；通过拉伸实验测其力学性能。同时选取新鲜猪小肠，按Abraham方法制备SIS。自SD大鼠四肢肌腱组织中提取肌腱细胞，进行肌腱细胞-PSIS组织工程支架构建。检测肌腱细胞的生长状况及肌腱细胞与PSIS支架之间的粘附情况。选择SD大鼠，于两侧腹壁分别制作全层腹壁缺损动物模型，行组织工程支架修复与单纯PSIS修复的自身对照研究，另设直接缝合组作为对照。分别于术后取材，免疫组织化学检测细胞浸润、PSIS降解及血管化状况，进行力学性能检测，了解两组支架在不同时间点的最大载荷和弹性慔量，透射电镜检测组织工程支架内的胶原纤维不同时间点的分布状况。.本课题组所构建的复合支架的VEGF体外缓释浓度均显著优于对照组（P <0.05），复合支架中MWCNT含量与VEGF缓释浓度正相关；细胞毒性研究发现MWCNT含量≤5%的复合支架不影响成纤维细胞的增殖（P >0.05），而MWCNT含量为10%的复合支架则明显抑制细胞增殖（P <0.05）；复合支架的力学强度均优于对照组（P <0.05）。应用肌腱细胞与SIS构建的组织工程支架体外检测表明肌腱细胞能够在SIS表面粘附生长，并且与近浆膜层SIS有更好的粘附。对血管生成的检测表明5周时组织工程支架组其交界区可见高密度血管，9周时血管化效果更加明显，而单纯SIS修复组血管化效果较差。CD31免疫组化检测结果证明组织工程支架修复组血管化效果优于单纯SIS修复组。力学强度检测表明两组支架的最大载荷无明显差异(P>0.05)，但组织工程支架比单纯SIS支架的弹性模量显著性增高(P<0.05)。透射电镜检测表明随着植入体内时间的延长，组织工程支架内胶原纤维数量逐渐增多，但直径没有明显改变。.本研究结果表明含5% MWCNT的PSIS复合支架具备良好的VEGF缓释性能和力学性能，其细胞毒性为0-1级，因而有可能成为一种新型腹壁缺损修复的材料。肌腱细胞-SIS组织工程支架修复腹壁缺损时表现出较好的生物力学、相容性及血管再生能力，该组织工程支架有可能实现更理想的腹壁缺损修复。