肝外胆管癌miR-373和DNA甲基化双向调控机制及生物学效应

microRNA(微小RNA)和DNA甲基化，都是在不改变DNA序列的条件下调控基因表达，具有肿瘤特异性和可逆性。研究显示，miRNA和DNA甲基化相互调控，但机制不清楚。肝外胆管癌预后极差，其中miR-373特异性表达降低，DNA甲基化转移酶3b(DNMT3b)和甲基化CpG结合蛋白2(Mecp2)表达升高。生物信息学分析发现，miR-373基因启动子含有CpG岛，DNMT3b和Mecp2的3'-UTR含有miR-373理论结合位点。因此，本项目拟一方面分析miR-373基因是否在DNMT3b和Mecp2作下，启动子发生甲基化而失活；另一方面分析miR-373能否作用于DNMT3b和Mecp2，抑制其生物活性，以剖析miRNA和DNA 甲基化双向调控机制；并以实验数据为依据，分析联合miRNA和脱甲基化药物对肿瘤细胞的抑制效应，探索肝外胆管癌分子干预的新策略。

microRNA(微小RNA)异常表达与特定肿瘤组织及临床特征相关。研究表明部分miRNA基因的CpG岛通过甲基化介导基因沉默。甲基CpG结合蛋白（MBP）通过结合甲基化的CpG二核苷酸抑制转录。本课题研究显示miR-373能够抑制胆管癌细胞生物学行为。通过生物信息学分析，预测miR-373基因启动子CpG岛片段长度为402bp，其中包含26个CpG位点和转录起始位点（TSS）。本研究拟明确miR-373在肝门部胆管癌中的表观遗传学调控机制。Taqman miRNA assay技术检测发现miR-373在肝门部胆管癌组织中低表达与肿瘤细胞低分化、高临床分期、总生存时间和无病生存时间相关。甲基化分析表明启动子CpG岛高甲基化抑制miR-373基因表达。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验表明，miR-373低表达能选择性募集MBD2至甲基化的CpG岛。相反，运用siRNA技术敲低MBD2后能够促进miR-373表达。应用脱甲基化药物5-Aza-CdR和乙酰化酶抑制剂TSA使miR-373再表达后能够降低MBD2在CpG岛区域的募集量。稳定转染pGL4-m373-Prom的胆管癌细胞株QBC939中MBD2在CpG岛区域的募集量增加。我们的研究表明在肝门部胆管癌的发生和进展中，miR-373基因靶向MBD2基因3-UTR区并负性调节MBD2基因表达，进而调控启动子CpG岛甲基化。