生物钟Bmal1调控骨骼肌缺血再灌注损伤及修复的机制研究

Previous studies in circadian clock Bmal1 have focused on suprachiasmatic nucleus, however, the role of Bmal1 in peripheral artery disease induced skeletal muscle ischemia reperfusion injury (IR) and repair remain unclear. The applicant found that the body weight of homozygous Bmal1-/- mice was consistently lower than that of the heterozygous Bmal1+/- mice. Quantitative PCR results showed that the expression of Bmal1 in IR muscles were much higher than that of the control. Through microarray analysis, we found for the first time that the loss of Bmal1 in skeletal muscle satellite cells was associated with up regulation of myostatin (Mstn), suggesting that Bmal1 has an inhibitory effect on the expression of Mstn. In this proposal, we will investigate whether Bmal1 bind to the promoter region of Mstn using ChIP assay; using the hindlimb ischemia reperfusion injury model, we will define the role of Bmal1 in skeletal muscle IR injury and repair using Bmal1-/- mice，satellite cell specific Bmal1 knockout mice (Pax7-Cre/Bmal1fl)，and wild type C57BL/6 mice; we will also define the role of Bmal1 in satellite cell proliferation, differentiation and self renewal using the Pax7-Cre/Bmal1fl mice.

以往在生物钟Bmal1领域的研究主要集中在视交叉上核，而Bmal1在周围血管疾病所导致的骨骼肌缺血再灌注损伤（IR）及修复过程中所起的作用仍不明确。申请人发现Bmal1-/-纯合子小鼠的体重明显低于杂合子Bmal1+/-。定量PCR结果显示Bmal1在IR肌肉中的表达明显高于对照组。利用基因芯片技术，申请人首次发现骨骼肌卫星细胞中Bmal1的缺失伴随肌生成抑制素（Mstn）表达的上调，提示Bmal1对Mstn的表达有抑制作用。本课题将利用染色质免疫沉淀技术明确Bmal1是否直接结合Mstn启动子从而抑制其表达；利用Bmal1-/-小鼠，卫星细胞特异性Bmal1敲除小鼠（Pax7-Cre/Bmal1fl），野生型C57BL/6小鼠及骨骼肌缺血再灌注模型，明确Bmal1对骨骼肌IR损伤及修复所起的作用；利用Pax7-Cre/Bmal1fl明确Bmal1对卫星细胞增殖，分化及自我更新能力的影响。

以往在生物钟Bmal1领域的研究主要集中在视交叉上核，而Bmal1在周围血管疾病所导致的骨骼肌缺血再灌注损伤（IR）及修复过程中所起的作用仍不明确。申请人研究发现：1. 全身敲除Bmal1（Bmal1-/-）导致小鼠体重下降，但并不影响小鼠的持续生长。 2. Bmal1基因的缺失导致小鼠肌纤维亚型的横截面积和比例均发生改变，表现为2a，2b，2x亚型的横截面积均小于同年龄的C57BL/6小鼠，而1型肌纤维的横截面积并无明显变化。Bmal1-/-小鼠肌纤维中2a及2x亚型的比例却高于同年龄的C57BL/6小鼠。3. Bmal1基因缺失导致小鼠成肌能力下降。 4. Bmal1缺失导致肌肉再生能力受损。5. Bmal1基因缺失导致Mstn表达上升，而Pax7表达下降。 6. Bmal1影响肌生成调节因子的表达。7. 卫星细胞特异性敲除Bmal1抑制肌肉再生。HE染色显示与Bmal1flox/flox相比，Bmal1scko小鼠IR损伤第5/7/10/28天的TA中新生肌纤维的数量和平均肌纤维面积均减少。8. Bmal1缺失抑制卫星细胞增殖。9. 染色质免疫共沉淀实验结果表明Bmal1在卫星细胞中直接调控Mstn的转录。综上，Bmal1对骨骼肌缺血损伤后再生的影响主要是通过激活MyoD从而促进卫星细胞的分化，通过抑制骨骼肌卫星细胞中的Mstn，促进卫星细胞的增殖，通过上调Pax7促进卫星细胞自我更新。研究成果为骨骼肌缺血损伤治疗提供了新的理论和方法以及重要的实验依据。