生物钟基因Clock和Bmal1对骨改建调控作用的机制研究

The circadian system is an integral part of mammalian physiology and regulates most biological functions along a 24-hour time night and day alternative. Recently, it was demonstrated that clock genes can play a role in the process of regulating bone metabolism through Wnt /β-catenin signaling pathway. However, the cellular and molecular mechanisms are still not clear.Therefore, the goal of this application is to characterize several clock geneknockout mice and ovserve the change of their bone morphology and osteoblasts and osteoclasts. Our hypothesis is that clock genes differentiatly regulate the bone cell proliferation and differentiation processes through Wnt /β-catenin signaling pathway. The outcome of the work will be helpful in understanding the regulation of bone formation by clock genes and possibly for treatment of osteoporosis.

个体的生命活动存在着以24小时为周期的交替变化，但何种生物钟基因如何调控生命代谢仍不清楚。目前研究表明，生物体内骨组织的改建也被生物钟基因所调控且同时经典Wnt /β-catenin信号通路可能参与其中。我们前期研究表明，Clock和Bmal1基因对于小鼠骨改建有着重要的作用，基因敲除的小鼠骨密度发生了改变。体外研究进一步证实，两种基因敲除对成骨细胞碱性磷酸酶的活性产生了影响。因此，我们提出假设：生物钟核心基因Bmal1和Clock可能通过Wnt经典和非经典信号通路对成骨细胞和破骨细胞产生重要的调控作用，参与并介导了昼夜规律对全身骨改建的影响。为验证此假说，我们将建立Clock和Bmal1基因敲除小鼠模型，采用分子生物学和组织化学的方法，研究其如何通过Wnt 信号通路对骨改建影响的内在机制，研究结果将有助于对代谢性骨病的认识，对治疗相应骨疾病提供新的药物靶点。

生物钟控制着自然界中个体生命活动的昼夜节律，而哺乳动物的许多生理过程都存在着以24小时为周期的交替变化。目前的研究表明，生物钟基因与炎症和骨代谢都存在着密切的联系，而牙周炎作为发生在牙周支持组织、伴随着牙槽骨吸收和改建的炎症性疾病，其发生发展过程与生物钟基因的关系尚未明确，NF-κB信号通路可能参与其中。前期研究表明，bmal1和clock基因对小鼠骨改建存在重要作用，本课题通过建立bmal1、clock基因敲除小鼠牙周炎模型，采用影像学、分子生物学和组织化学的方法，探讨生物钟基因bmal1、clock在小鼠牙周炎进展中对NF-κB通路的调控作用及对下游炎症因子表达的影响。利用口腔植菌建立bmal1、clock基因敲除小鼠牙周炎模型，micro-CT和组织学检测骨吸收及组织破坏情况，结果显示Bmal1基因敲除小鼠的牙周炎骨吸收及组织破坏均较野生型小鼠加重，而clock基因敲除小鼠的牙周炎表型减轻。qRT-PCR检测牙槽骨中参与NF-κB通路激活的关键蛋白p65及下游炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达情况，bmal1基因敲除小鼠中p65及炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达较野生型升高，而在clock基因敲除小鼠中降低。组织切片免疫荧光检测p65在牙周组织中的表达与核内转移情况显示，在bmal1基因敲除小鼠的中，p65表达升高，且向胞核内转移增加，而在clock基因敲除小鼠中的结果则相反。体外培养bmal1小鼠的骨髓巨噬细胞，给与LPS刺激，qRT-PCR检测结果显示，IL-1β、IL-6的表达升高较野生型显著，细胞爬片免疫荧光染色显示，p65向胞核内的转移增加。综合上述结果，敲除bmal1基因加重小鼠牙周炎的骨吸收和组织破坏，上调NF-κB信号通路的激活，加重牙周组织的炎症反应，而敲除clock基因减轻牙周炎表型，下调NF-κB信号通路的激活，减轻牙周组织的炎症反应，提示bmal1基因对牙周炎存在保护作用，而clock基因对牙周炎有促进作用，为研究生物钟控制的昼夜节律紊乱与细菌性牙周炎之间的关系提供参考。