清肝利水方调控TRPC6/Ca2+信号通路抑制慢性青光眼RGCs凋亡的机制研究

Glaucoma optic nerve atrophy is a chronic progressive development, resulting in blindness. At present, there is no ideal therapy. Professor Zou jusheng experience of Qing-Gan-Li-Shui formula has the effect of clear liver benefit water. The clinical observation and animal experiment showed that it could decrease the Intraocular pressure and improve the damage of retinal ganglion cells. We established a stable SD rat chronic ocular hypertension model to simulate the pathological environment of chronic simple glaucoma. Through the regulation of TRPC6 membrane protein and ca2+ channel, we explored the correlation between RGCs apoptosis and the concentration of RPC6 and ca2+ in the cell, and explored the protective mechanism against RGCs apoptosis.

青光眼视神经萎缩呈慢性进行性发展，最终导致失明。目前临床缺乏理想的治疗药物。我院邹菊生经验方清肝利水方具有清肝利水明目的功效。经前期的临床观察及动物实验显示其有降低眼压、改善视网膜神经节细胞损伤的作用，但具体作用机制不明。我们通过建立稳定的SD大鼠慢性高眼压模型以模拟慢性单纯性青光眼的病理环境，通过对TRPC6膜蛋白及Ca2+通道的调控，探索清肝利水方抑制慢性青光眼RGCs凋亡与TRPC6及胞内Ca2+浓度的相关性，探索抗RGCs凋亡的保护机制，从而为清肝利水方保护RGCs的机制研究提供一个新的思路与途径。

基于“肝开窍于目”理论，从肝论治青光眼的基本共识，在清肝利水方临床疗效确切和前期研究发现其有降低眼压、改善视网膜神经节细胞损伤的作用的基础上，本项目研究清肝利水方对青光眼模型RGC的保护作用。从体内、体外实验对相关蛋白进行分析，阐明TRPC6/Ca2+通路在RGC凋亡过程中的作用及清肝利水方的干预机制。体内实验用清肝利水方干预SD大鼠慢性高眼压模型：（1）建立慢性高眼压青光眼大鼠模型；（2）清肝利水方能够降低大鼠慢性高眼压青光眼的眼压，降压效果与中药浓度有一定的相关性。（3）下调TRPC6通道蛋白表达：中、高中药组及阳性对照组TRPC6表达较模型组明显下降；（4）下调凋亡蛋白Caspase-3、Bax：各中药组Caspase-3蛋白表达较模型组均有下降，且中浓度中药组差异最明显；各中药组视网膜Bax蛋白的表达均低于模型组，差异有统计学意义；（5）上调抗凋亡蛋白Bcl-2：各中药组Bcl-2蛋白的相对表达均有增高，与模型组比较差异有统计学意义；其中中浓度中药组的Bcl-2/ Bax相较低、高浓度中药组最大。体外实验用清肝利水方含药血清干预缺氧缺糖-复氧复糖RGC损伤模型：（1）制备SD大鼠清肝利水方含药血清，进行细胞毒性试验，选取最高5%无细胞毒性浓度作为干预浓度；（2）建立RGC细胞缺氧缺糖-复氧复糖损伤模型，检测各组的细胞增殖力，低、中中药组可显著提高缺氧缺糖-复氧复糖损伤的细胞存活率；（3）细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡水平：清肝利水方可降低RGC中TRPC6、Caspase-3、Bax表达，提高Bcl-2表达，抑制RGC凋亡；（5）检测细胞内钙离子浓度：模型组细胞内Ca2+明显增加而导致细胞损伤，用药后，中、高中药组细胞内Ca2+浓度下降。清肝利水方保护视神经的机制可能与降低TRPC6表达以减少Ca2+内流相关。本研究为青光眼RGC保护创新了新思路、提供了清肝利水新方法。