HSP70介导线粒体通路保护热应激鹅肠黏膜机械屏障的分子机制研究

Heat stress is a key factor that impact summer goose production.The damage of intestinal mucosal barrier function is the core symptom of heat stress. Heat shock protein 70（HSP 70 ）is the important protective factor resisted cell injury and apoptosis resulted from heat stress, it’s cell protective function and the relative molecular mechanism are always the research highlights. Based on the previous research on the behavior rhythm, tissues and organ injury, nutrients digestion and metabolism, HSP70 and HSP70mRNA expression of goose subjected heat stress. The model of HSP 70 high expression goose and intestine mucosa cell would be established,then the protection of HSP70 on the intestinal mucosal barrier and the variation of key factors of mitochondria pathway in the biologica effects mediated by HSP70 would be studied using the flow cytometry, fluorogenic quantitative PCR, western-blot, immunohistochemistry technique, in vivo and in vitro. Furthermore, the relationship among the HSP70, cell apoptosis mitochondria pathway and intestine barrier function would be analyzed to explore the molecular mechanism of HSP70 protect intestine mucosa mechanical barrier in the goose subjected heat stress. The results would provide theory for prevention and treatment heat stress injury to animal and the study the development of anti-heat stress nutrients.

热应激是危害夏季鹅业生产的重要因素，小肠黏膜屏障功能的破坏是动物一系列应激症状的核心。热休克蛋白70（HSP70）是应激诱导的抵制机体细胞损伤和凋亡的重要保护因子，其细胞保护功能和相关分子机制一直是国内外学者的研究热点。课题组基于热应激鹅行为节律、组织器官损伤、消化代谢、HSP70及其mRNA表达等领域的研究积累，拟通过HSP70上调表达动物和肠上皮细胞模型的建立，应用流式细胞术，荧光定量PCR，western-blot，免疫组化等技术，从体内和体外两个层次系统测定、分析热应激条件下，HSP70对肠黏膜屏障的保护作用，线粒体信号通路关键因子在HSP70介导的生物学效应中的表达变化，以期阐明HSP70—细胞凋亡线粒体通路—肠道屏障功能间的相互联系，从分子、细胞和个体水平探讨HSP70介导线粒体通路保护热应激鹅肠黏膜屏障的分子机制，为预防、治疗动物热应激损伤及抗热应激营养素的研发奠定理论基础。

热应激是危害夏季鹅业生产的重要因素，严重影响鹅健康与生产性能。改善畜禽所处温热环境固然是解决应激问题的直接途径，但能源、成本等诸多因素使其难以实施。深入揭示动物的热应激损伤及自身保护机制，进而有效提高动物机体的抗应激能力，缓解热应激损伤成为了当前国内外环境营养领域的研究前沿与热点。本研究利用谷氨酰胺（Gln）作诱导剂，通过建立鹅肠道及体外分离的鹅肠上皮细胞Hsp70上调表达模型，研究热应激条件下，Hsp70对肠黏膜屏障的保护作用，线粒体信号通路关键因子在Hsp70介导的生物学效应中的表达变化，探讨Hsp70保护热应激鹅肠黏膜屏障的分子机制。. 研究发现：热应激状态下Hsp70上调表达显著提高鹅血液中T3活性（P<0.01），降低CK（P<0.01）、LDH（P<0.01）、T4（P<0.01）、CORT（P<0.01）活性，其中 CK、LDH恢复至对照组水平；Hsp70上调表达通过降低热应激鹅DAO和 DLA浓度，提高热应激鹅肠黏膜Claudin-1（P<0.01）、Occludin（P<0.01）、ZO-1（P<0.01）蛋白及mRNA的表达水平缓解热应激对鹅造成的肠道通透性升高问题，维持肠道机械屏障完整性，进而保护肠黏膜屏障系统结构和功能，切片观察结果也证实了Hsp70上调表达组对热应激鹅肠道损伤的保护用。Hsp70上调表达可显著降低热应激条件下鹅小肠上皮细胞凋亡（P<0.01），显著提高热应激鹅肠上皮细胞线粒体膜电位（P<0.01）及Cyt C含量，降低胞浆Cyt C含量（P<0.01），抗凋亡因子Bcl-2mRNA及蛋白表达水平显著升高（P<0.01），Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3 mRNA和蛋白的表达量显著降低（P<0.01），Hsp70的上调表达通过改善细胞凋亡线粒体通路相关因子的表达，提高线粒体膜电位，抑制细胞色素C从线粒体向胞浆的释放，使得线粒体信号转导通路诱导的细胞凋亡减少，从而达到降低热应激细胞损伤的作用。. 本研究阐明了HSP70—细胞凋亡线粒体通路—肠道屏障功能间的相互联系，从分子、细胞和个体水平探讨HSP70介导线粒体通路保护热应激鹅肠黏膜屏障的分子机制，为预防、治疗动物热应激损伤及抗热应激营养素的研发奠定理论基础。