仔猪肠道黏膜ETEC噬菌体保护肠道黏膜屏障功能及其定植肠黏膜的机制研究

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is the main infectious agent of post-weaning diarrhea (PWD), which adheres to intestinal mucosa and damages gut mucosa barrier. Our preliminary in vitro studies found that ETEC phage isolated from piglet intestinal mucosa are more capable of adhering to cell and reducing the colonization and proliferation of ETEC on intestinal epithelial cells than phage isolated from piglet intestinal chyme. In this study we plan to apply a variety of methods ( Real-Time PCR, western-blot, ELISA, Sequencing) to determine the efficacy of mucosal phages in prevention of diarrhea and protection of intestinal mucosa due to experimental ETEC infection in weaned pigs. Enterocytes tight junction protein ZO-1, claudin-1 and Claudin-4 will be determined in protein and gene levels. Furthermore, we will search for the key amino acid sequence promoting mucosal phages adhering to epithelial cells by alignment analysis the Ig-like domain sequence of mucosal and chymous phages, and the suspected key amino acid sequence mutated phages will be constructed by using homologous recombination and CRISPR / Cas system. The key amino acid sequence will be ultimately identified by in vitro and in vivo experiments which will assess the ability of mutated phages on adhering to cell and colonizing on intestinal mucosa. Through these, we anticipate to uncover protective effect and colonization mechanism of ETEC phage on piglet intestinal mucosa. This study elucidates the ecological effects of mucosal ETEC phages in the gut and provides a new frame work guidelines for strategies towards diarrhea prevention in piglet.

产肠毒素大肠杆菌（ETEC）黏附于肠黏膜，破坏黏膜屏障，进而诱发仔猪腹泻。申请者拟在前期体外研究发现从仔猪肠道黏膜比食糜里分离到的ETEC噬菌体具有更强黏附细胞的能力且更显著减少ETEC在肠上皮细胞上定殖的基础上，通过动物试验，应用荧光定量、免疫印迹等方法研究黏膜ETEC噬菌体对ETEC处理后的断奶仔猪的保护作用以及对小肠形态、上皮细胞紧密连接蛋白表达的影响，明确黏膜噬菌体对肠黏膜屏障的保护机制。在此基础上，比对分析黏膜和食糜噬菌体Ig样结构域序列差异以及利用蛋白结构和功能预测软件找寻促进黏膜噬菌体黏附细胞的关键氨基酸序列，应用同源重组和CRISPR/Cas系统将其基因突变，构建噬菌体突变株，再通过细胞黏附试验和体内定植试验验证找寻到的关键氨基酸序列对黏膜噬菌体黏附肠上皮的作用，从而解析黏膜噬菌体定植肠黏膜的机制。本研究为噬菌体成为一种新型抗生素替代品以及仔猪腹泻预防措施的制订提供新思路。

本研究首先探究了猪肠道大肠杆菌噬菌体的分布情况，通过分离三个猪场猪空场和结肠食糜和黏膜上的噬菌体，发现猪肠道存在食糜特异和黏膜特异的噬菌体，且食糜噬菌体多样性高于黏膜噬菌体。此外，猪肠道还存在核心噬菌体，跨属感染的多价噬菌体，以及可裂解ETEC的噬菌体并均有显著抑制ETEC生长的能力。然后我们选取了核心噬菌体，黏膜特异噬菌体，食糜特异噬菌体以及可以裂解ETEC的噬菌体，通过体外和体内和试验研究了噬菌体黏附肠上皮的特性，发现噬菌体的特性如下：噬菌体松散黏附于肠上皮黏液层，不同噬菌体黏附能力不同，但噬菌体黏附能力的强弱与分离部位无关，噬菌体在肠道的黏附数量主要取决于噬菌体在肠道内的数量和在肠道的存活能力以及肠道内宿主菌的数量。此外，还选择了大肠杆菌噬菌体与另外四株其他菌属的噬菌体共同黏附肠上皮，发现噬菌体黏附不存在竞争占位效应。我们进一步通过体外和体内试验研究了噬菌体黏附后保护肠上皮抵抗细菌侵袭的效果，发现噬菌体可减少体外细胞培养液以及黏附于细胞上的细菌的数量，小鼠提前灌胃噬菌体可以减缓致病菌导致的体重下降，以及降低粪中致病菌的数量。在确认了噬菌体对肠道有保护作用后，继续研究了噬菌体对机体健康的影响。对小鼠连续14天后停喂七天，发现灌胃噬菌体会影响α多样性和β多样以及肠道菌群结构。灌胃噬菌体14天也会影响肠道黏膜基因转录水平，小肠黏膜转录组分析显示灌胃噬菌体组在生物调节、细胞过程、细胞组建等呈现较高的差异基因表达数目。本研究证实了噬菌体可定植于肠道黏膜，保护肠黏膜抵抗细菌的侵袭，并且噬菌体本身对机体健康无明显副作用，为噬菌体替抗研究提供了研究基础，也为仔猪腹泻预防措施的制订提供新思路。