益气活血法对脑出血后凝血酶清除的二元动态调控机制研究

A large amount of thrombin release is the major cause of post intracerebral hemorrhage (ICH) injury. This program is exploring the effect of qi-tonifying and stasis-eliminating (QTSE) therapy on binary dynamic process of thrombin clearance by glia after ICH (astrocyte-limited thrombin spreading and microglia-phagocyted thrombin). In vivo study: after induce autologous blood ICH model or thrombin-infusion model, laser confocal method, western blot, quantum dots label, fluorescence activated cell sorting (FACS) are used to investigate the effect of QTSE on astrocyte/microglia activation, thrombin limitation/phagocytosis. Inflammatory response, brain injury and repair are evaluated to study the effect of thrombin clearance. In vitro study: the Buyanghuanwu decoction-containing serum is used as intervention, CCK-8, FACS, ELISA are applied to evaluate the effect of thrombin on astrocyte/microglia activation and limitation/phagocytosis of thrombin as well as the influence of QTSE therapy. By investigating the glial mechanism of binary dynamic process of thrombin clearance, we can add the understanding of QTSE therapy in treating ICH.

大量凝血酶释放是脑出血（ICH）损伤的元凶之一。前期发现益气活血法治疗ICH可降低凝血酶水平。本项目拟从胶质细胞清除凝血酶（星形胶质细胞限制凝血酶扩散、小胶质细胞吞噬凝血酶）的二元动态角度，探索益气活血法治疗ICH的机制。内容：以补阳还五汤及方中的活血药为工具，体内建立大鼠自体血ICH模型、凝血酶鼠脑注射模型，采用激光共聚焦、分子生物学、量子点标记、流式活化细胞分选等技术，研究益气活血法对ICH后星形胶质细胞/小胶质细胞活化，限制/吞噬凝血酶及相关通路蛋白的影响；评价炎症反应、脑组织损伤、修复，探讨凝血酶清除对ICH脑组织的影响。体外以中药含药血清干预，通过CCK-8、流式细胞分选、ELISA等方法，评价凝血酶对星形胶质细胞/小胶质细胞活化、星形胶质细胞/小胶质细胞对凝血酶限制/吞噬作用。意义：通过研究ICH后胶质细胞清除凝血酶的二元动态过程及机制，阐释益气活血法治疗ICH的作用机理。

大量凝血酶释放是脑出血（ICH）损伤的元凶。课题组前期工作提示益气活血法治疗ICH可降低凝血酶水平。本课题主要研究内容为：ICH后星形胶质细胞、小胶质细胞清除凝血酶的二元动态调控机制及益气活血法的干预作用。研究发现：同一时间点，ICH后，星形胶质细胞增殖、活化后形成胶质瘢痕限制凝血酶的扩散；而PAR-1抑制剂SCH79797可显著抑制星形胶质细胞增殖、活化及胶质瘢痕的形成；益气活血法代表方补阳还五汤干预可通过PAR-1-ERK1/2通路显著促进星形胶质细胞增殖、活化及胶质瘢痕的形成。SCH79797可阻断补阳还五汤的该效应。同一时间点，ICH后，小胶质细胞增殖、活化吞噬受限的凝血酶。SCH79797可显著抑制小胶质细胞增殖、活化及对凝血酶的吞噬。补阳还五汤干预可通过PAR-1-ERK1/2通路显著促进小胶质细胞增殖、活化，进一步经AC/cAMP/PKA/LRP-1通路，介导小胶质细胞吞噬凝血酶。而SCH79797可阻断补阳还五汤的该效应。Western blot示：假手术组无明显thrombin表达。同一时间点，SCH79797组thrombin表达水平较ICH组显著增加（P<0.05，7d，14d；P<0.01，3d），BYHWD组较ICH组表达显著减少（P<0.05），而SCH79797可明显阻断BYHWD组的效应（P<0.05，3d；P<0.01，7d，14d）。免疫荧光示：假手术组未见明显tunel阳性细胞表达。同一时间点，ICH组可见较多tunel阳性细胞，SCH79797组tunel阳性细胞数量较ICH组显著增加（P<0.01），BYHWD组tunel阳性细胞数量较ICH组表达显著减少（P<0.05），而SCH79797可明显阻断BYHWD组的效应（P<0.01）。免疫组化IgG染色显示：假手术组未见IgG漏出，ICH组可见明显IgG染色，SCH79797组IgG染色较ICH组明显加深（P<0.05）。ICH后，益气活血干预可减少IgG漏出（P<0.05），而SCH79797可明显阻断BYHWD组的效应（P<0.01）。行为学观察提示：ICH组有神经功能缺损表现，SCH79797加重ICH组神经缺损，补阳还五汤干预促进神经功能恢复，该效应可被SCH79797抑制。本项目通过研究ICH后胶质细胞清除凝血酶的二元动态过程及机制，阐释益气活血治疗ICH的机制。