Ebp1介导的PI3K/Akt/mTOR信号途径在宫颈癌细胞增殖与分化中的作用

Ebpl is a newly discovered ErbB-3 intracellular binding protein, which has two different fragments: p42 and p48. In the previous study, we found Ebp1 overexpressed in cervical cancer and high expression of Ebp1 promoted proliferation of cervical cancer cell line HeLa and Akt phosphorylation. However, the mechanism of Ebpl effect on proliferation and differentiation of cervical cancer cells is not clear yet. It is well known that PI3K/Akt/mTOR signal pathway is Closely related to tumor development. p42 inhibits proliferation of tumor cells and induces cell differentiation via negative regulation on p85 subunit and Akt activity. However, p48 promote proliferation of cells via activation effect on phosphorylation of Akt. We assume that Ebp1 regulates proliferation and differentiation of cervical cancer cells through PI3K/Akt/mTOR signaling. In this study, we will establish p42 or p48 overexpressed cervical cancer cell lines by transfection and siRNA to investigate the regulatory effect of p42 and p48 on PI3K/Akt/mTOR signal pathway and analyze if PI3K/Akt/mTOR signaling pathway is essential to proliferation and differentiation of cervical cancer cells by Ebp1.

Ebpl是新发现的ErbB-3胞内结合蛋白，具有p42和p48两个不同片段。我们在前期研究中发现Ebp1在宫颈癌组织中高表达，且Ebp1高表达促进宫颈癌HeLa细胞增殖和Akt的磷酸化，但是Ebpl在宫颈癌细胞增殖与分化中的作用机制尚不清楚。PI3K/Akt/mTOR信号通路与肿瘤的发生发展密切相关，p42负性调节p85亚单位和Akt的活性，抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞分化，但是p48可激活Akt的磷酸化，并促进细胞增殖。因而我们设想Ebp1通过PI3K/Akt/mTOR信号分子调控宫颈癌细胞生长增殖与分化。本课题采用基因转染和siRNA技术，建立高表达p42或p48的宫颈癌细胞系，探讨Ebp1两个不同片段对PI3K/Akt/mTOR信号途径的调控；在此基础上结合分子生物学、细胞生物学和药理学等方法和技术，分析Ebp1促宫颈癌细胞增殖与分化作用对PI3K/Akt/mTOR信号途径的依赖性。

宫颈癌为全球妇女恶性疾病中占第二位，严重威胁着妇女的健康和生命安全。Ebp1是新发现的一种ErbB-3胞内结合蛋白，是增殖相关的PA2G4家族中的一员。尽管国内外已有Ebp1在乳腺癌、前列腺癌等肿瘤中的研究报道，但Ebp1在宫颈癌中作用研究尚未见报道。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞生长增殖、及细胞周期调控等方面起重要作用。本研究1）收集不同潜能手术切除的宫颈组织，采用生物信息学技术结合分子生物学等方法，检测了Ebp1、Ki67等相关生物标志物表达和活性变化，结果显示宫颈癌组织中上述蛋白的表达率明显高于癌旁组织，且各标志物之间表达呈正相关。2）建立沉默Ebp1的宫颈癌细胞系，进行细胞生物功能检测。细胞生长计数实验表明沉默Ebp1显著抑制宫颈癌细胞生长；CCK8结果显示沉默Ebp1的宫颈癌HeLa细胞增殖率明显低于对照组；平板克隆实验检测结果显示与对照组相比沉默Ebp1组克隆集落形成明显减少；通过划痕实验观察沉默Ebp1组宫颈癌细胞增殖迁移能力明显低于对照组；Transwell侵袭实验观察结果显示沉默Ebp1组迁移到小室的细胞数明显少于对照组；流式细胞仪检测结果显示沉默Ebp1组保持活力的宫颈癌细胞数明显减少，G1期细胞数明显增加，而S期细胞数减少，提示抑制Ebp1的表达可引起细胞周期阻滞，Ebp1的表达促进宫颈癌细胞增殖活性；3）建立Ebp1高表达的宫颈癌细胞系后，检测Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平，结果发现其磷酸化蛋白表达水平明显上调，提示高表达Ebp1可激活PI3K/Akt/mTOR信号通路。4）利用PI3K抑制剂和mTOR抑制剂对高表达Ebp1的宫颈癌细胞进行CCK8、细胞划痕、平板克隆等检测，结果显示均抑制宫颈癌细胞生长增殖能力，且Western blot结果发现，AKT、mTOR的磷酸化分别被抑制，提示高表达Ebp1诱导PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，且这一过程促进了宫颈癌细胞的增殖。总之，通过本研究证实了Ebp1高表达促进宫颈癌细胞增殖与分化，改变细胞周期调控宫颈癌恶性生物学行为，其作用可能通过PI3K/Akt/mTOR信号途径。