酿酒酵母核糖体40S亚基的人工合成与功能分析

Historically, the ribosome is well known as a complex “molecular machine”, with constitutive rather than intrinsic regulatory capacity in mRNA translation. Emerging studies are revealing unexpected roles for the ribosome in directing the translation of specific subpools of mRNAs, inspiring a new frontier for evaluating the hypothesis of “specilized ribosome” or “ribosomal code”. .In many organisms (such as yeast, plants and flies), many ribosome proteins (RPs) are encoded by parologues that show distinct or even opposite expression patterns and functions. This contributes to the so-called “RPs heterogeneity”. And such heterogeneity of RPs in ribosome composition, is proposed to generate “specilized ribosomes”, which are fine-tuned to specilize mRNA translation. However, definitive evidence for the existence of specialized ribosomes was obscured by the challenges in identification, homogenization, and characterization of “specilized ribosomes”, which are buried in the highly diversified naturally occurring ribosome pool in wild-type cells..The small ribosomal subunit (40S) plays a central role in translation initiation, which is the target of regualtion in a wide range of cellular process. In this work, we propose to design, synthesis and functional analysis of “designer” yeast 40S ribosomes with high plasticity in the aspect of RPs composition. And we hope this will pave a way for the ribosome biology with such engineered ribosomes.

核糖体是生产蛋白质的细胞器，是生命中心法则信息流向的关键掌舵者之一。核糖体由众多蛋白质与RNA装配而成，可在特定时空下“选择性”翻译特定mRNA，解析核糖体组装与选择性翻译调控机理是当前领域内重点关注的前沿科学问题。既往研究提示，核糖体蛋白质异质性是核糖体功能调控的结构基础之一，然而现阶段仍缺乏直接证据。究其原因，主要是天然细胞中的核糖体类型纷繁复杂，目前缺乏良好的细胞模型，用以直接研究核糖体蛋白质异质性对核糖体性能及细胞功能的影响。核糖体40S亚基是识别、起始mRNA翻译的枢纽，本课题拟采用合成生物学的理论方法，以操纵蛋白编码基因作为切入点，创建出核糖体40S亚基蛋白质具有高可塑性的酵母底盘细胞；进一步，人工进化出核糖体蛋白质异质性大幅度下降的系列细胞模型，以便研究核糖体蛋白质异质性对核糖体及细胞功能的影响，最终为核糖体生物学相关研究提供新的研究模型及线索。

核糖体是生产蛋白质的细胞器，是生命中心法则信息流向的关键掌舵者之一。 既往研究提示，核糖体蛋白质异质性是核糖体功能调控的结构基础之一，然而现阶段仍缺乏直接证据。究其原因，主要是天然细胞中的核糖体类型纷繁复杂，目前缺乏良好的细胞模型，用以直接研究核糖体蛋白质异质性对核糖体性能及细胞功能的影响。.在青年科学基金的资助下，本项研究工作开发了新型的基因组连续进化工具iCasEvo（iterative cas9-mediated evolution），可实现连续高效的多重基因编辑；基于iCasEvo技术，通过连续敲除多余的编码酿酒酵母核糖体40S亚基核糖体同源蛋白的编码基因，只保留一套核糖体40S亚基核糖体同源蛋白的编码基因，创建了核糖体40S亚基单体型酵母细胞模型（命名为Homo-40S）。进一步通过对核糖体40S亚基单体型酵母细胞模型进行功能分析发现，系统性敲除核糖体蛋白变体影响核糖体的翻译活性和准确度等翻译特性；进一步对其作用机制研究发现，核糖体蛋白变体主要通过剂量补偿作用调控核糖体的翻译活性和准确度等功能特性；此外，我们研究发现，Homo-40S可通过小规模突变或大规模的基因组加倍方式，提高环境适应能力（如提升对蛋白合成抑制剂的抵抗力或生长速率）。.综上，本研究工作开发了新型的基因组连续进化工具iCasEvo，通过创建核糖体40S亚基单体型酵母细胞模型，发现核糖体蛋白变体主要通过剂量补偿作用调控核糖体的翻译活性和准确度等功能特性，为探究领域内备受关注的前沿科学问题即解析核糖体的结构-功能调控密码提供了新的解题思路，也为后续设计创建人工核糖体奠定了一定理论和技术基础。研究的相关结果已被国际知名期刊Proceedings of the National Academy of Sciences，PNAS接受。