人工酵母染色体上稀有密码子特性及其替换规律探究

What is the role of the rare codon is the fundamental question in molecular biology. Also, expanding genetic codon to enable the incorporation of the non-canonical/standard amino acid in industrial microbes is one of the aims in Synthetic biology. However, as recent research revealed, synonymous codon reassignment of some rare sense codons is not allowed in certain sites in the genome due to their unknown effect, causing the failure of genome-wide recoding. Therefore, it is essential to explore the role of rare sense codons in the genome and their substitution rule. Hence, we apply eukaryotic multiplex automated genome engineering technology to recode all the CGG codon on the synthetic yeast chromosome II simultaneously, screening for CGG codons and recode scheme that are not allowed. Then, study the factors that contribute to this effect by assaying the recoded strain at genomics, transcriptional and translational level. By figure out the feature of these CGG codons, we could speculate their reassignment rule, deepening our understanding on the role of rare sense codon and providing basis for chassis yeast cell engineering.

探究稀有密码子的特殊作用，是分子生物学的研究热点之一。同时，扩增密码子表，构建编码非标准氨基酸的正交生物体系，是合成生物学的一大目标。而由于稀有有义密码子在真核基因组上的未知特殊作用，使得全基因组密码子同义替换难以实现。因此，需找出基因组中特殊的稀有有义密码子，并研究其特性及替换规则。为此，本项目拟以人工酵母合成型II号染色体上所有的CGG密码子为研究对象，通过多位点基因编辑技术对CGG进行多位点多组合同义替换，找出特殊的CGG密码子和替换组合，进而对特殊的CGG密码子和替换组合进行深入的同义替换研究，探究特殊CGG密码子的特性，推测其替换规则。本项目将加深我们对稀有有义密码子特殊作用的理解，为后续底盘细胞改造提供依据与指导。

通过同义密码子替换扩展密码子表是构建真核密码子拓展技术底盘细胞的重要研究方向。然而，因密码子偏好性引起的同义替换后表型发生变化的底层机理仍不清晰，因此亟需在真核工程微生物中进行系统性的同义替换研究。已有研究表明，在真核生物中同义密码子主要通过mRNA二级结构变化、局部密码子偏好性和三联密码子偏好性产生对细胞表型的影响。本课题对酿酒酵母合成型II号染色体（synII）上关键基因内的稀有密码子CGG进行了设计和替换，研究影响同义替换后引起表型变化的关键因素，为后续底盘菌株构建提供指导。本课题首先定位了synII染色体上29个关键基因内的47个CGG密码子，基于上述3种因素建立了一套同义密码子替换后对表型影响的打分算法，采取“同义替换后表型影响最小原则”确定了所有目标CGG的同义替换选择。尝试开发的单个CGG密码子特殊位点的初步快速筛选方法和多位点同时精准编辑的基因组编辑方法（已申请专利）加速CGG同义替换的潜在规律探究。最后，本课题采用基于传统酵母同源重组片段替换的方法，平行地完成了29个关键基因内47个目标CGG密码子的替换，并对相应菌株进行了表型测试。结果显示在常规及压力条件（转录与翻译抑制）下，单个CGG位点的同义替换未产生明显的表型缺陷。综上所述，通过对基因组上CGG密码子的同义替换，本研究未发现酿酒酵母synII染色体中显著影响表型的CGG位点，暗示出稀有密码子具有较高的重编可塑性。此外，在进行基因组水平的系统性同义替换时，将同义替换前后对目标基因mRNA二级结构、目标密码子区域偏好性和三联密码子偏好性影响降至最小，可能有助于降低某些特殊稀有密码子位点同义替换时对细胞活性的影响。本课题研究结果可能在后续构建真核底盘工程微生物时，特别是在构建能稳定正交编码非标准氨基酸的真核底盘工程微生物时具有一定的指导意义。