纤维寡糖转运系统在丙酮丁醇梭菌中的整合及其对纤维寡糖转运和利用的影响研究

Cellulose is the most abundant renewable resource in nature, and it is a suitable feedstock for low-cost industrial fermentative production of biofuel butanol. It is a key issue yet to be resolved that the efficient and fully conversion of various sugars in the cellulose hydrolyzate. By importing of the cellodextrins transporter system into microorganisms producing butanol, it is possible to achieve simultaneous co-fermentation of glucose and cellodextrins. Then, the efficiency of cellulose-butanol fermentation will be increased. In this research, study of integration of cellodextrins transporter into Clostridium acetobutylicum will be carried out. The cellodextrins transporter from Clostridium thermocellum will be imported and integrated into Clostridium acetobutylicum. This will make Clostridium acetobutylicum possess the ability to transport and utilize cellodextrins. Analysis and improvement of the stability and transport capability of this transporter will be performed, and the key amino acids in transporter protein are determined combinated of DSC, ITC and molecular modification techniques.These would result in the construction of a cellodextrins transport system for Clostridium acetobutylicum, and a base for high efficient butanol fermentation with cellulose as feedstock.

纤维素是自然界中最为丰富的可再生资源，是低成本工业化发酵生产生物质能源-丁醇的关键因素。在纤维素的水解产物发酵中，各种糖份的高效充分转化是有待于解决的难题。通过在丁醇发酵微生物中引入纤维寡精的跨膜转运系统，从而实现葡萄糖和寡糖的同步转运和共发酵，将可以提高纤维素丁醇的效率。 在本研究中，开展异源纤维寡糖转运系统在丙酮丁醇梭菌中的整合研究。把来自热纤梭菌的纤维寡糖转运系统整合到丙酮丁醇梭菌中，使丙酮丁醇梭菌具有纤维寡糖的跨膜运输和利用的能力。结合DSC和ITC技术和蛋白质定点改造技术对转运系统的蛋白质进行亲和能力的关键氨基酸分析以及分子进化突变，研究和提高转运系统的稳定性和转运能力。从而建立一套适合于丙酮丁醇梭菌的纤维寡糖转运系统，为进行高效率的纤维素丁醇发酵建立研究基础。

在生物质炼制的环节中，生物质经由物理或是化学方法预处理后，由酶解方式降解成单糖，再单糖跨膜运输到细胞内进行代谢。形成一个以单糖为终产物的生物质降解和利用流程。这个流程，酶的成本占了生物炼制成本的大头。. 以纤维素的生物炼制为例，主要的瓶颈在于纤维素酶的使用成本过高上面。纤维素原料的发酵，一般的流程是：第一步预处理；第二步酶水解，使用纤维素酶从纤维素的内部进行随机的酶切，产生各种纤维寡糖，纤维寡糖再被纤维素酶分解成纤维二糖，纤维二糖再分解成葡萄糖，葡萄糖跨膜运输到微生物体内进行代谢。.以单糖为终产物的降解和利用途径，导致水解过程中需要大量的纤维素酶以及精细的配比酶系。而在纤维素的预处理过程中，产生了各种纤维寡糖。如果在这个步骤就能对寡糖原料进行发酵利用，就避免了后面的各种处理步骤。也能减少纤维素酶的投放量。从而减少了成本。因而从寡糖的跨膜运输和利用入手，对微生物的直接寡糖运输和利用进行分析，获得工业微生物的寡糖运输和利用的能力，将可以促进生物炼制的发展。. 本项目从这个角度出发，研究在微生物中和纤维寡糖利用相关的各种转运系统和转运系统的基因。建立了在厌氧梭菌丙酮丁醇梭菌中的纤维寡糖转运系统的基因构建、基因的异源重组导入体系。获得了在梭菌中进行异源重组的转运系统。建立起寡糖转运系统稳定性测试体系。对一系列的寡糖转运系统在各种醇溶液中的稳定性进行测试，收集和分析了这些稳定性数据。对cbp结合蛋白的蛋白质稳定性进行研究，分析在乙醇、丁醇的不同浓度条件下，转运结合蛋白质的稳定性表现。对不同微生物来源的寡糖转运体系进行基因搜寻和基因表达验证，新克隆和鉴定了一批来自梭菌的转运蛋白新基因。对寡糖降解途径中相关的酶体系进行分析和鉴定，克隆和鉴定相关的酶基因。对寡糖（以二糖作为验证）在梭菌中的转运和水解进行验证，建立了高转运能力的重组梭菌。研究工作为建立能直接利用寡糖的工业菌株建立基础。