寡糖转运在嗜碱芽孢杆菌 N16-5 半纤维素利用中的作用研究

Bacillus sp. N16-5 is an alkaliphilic hemicellulolytic bacterium. In previous research, its xylan and mannan utilization related gene clusters were identified, which encode transporters for oligosaccharides and many intracellular hydrolases. It suggested that Bacillus sp. N16-5 degraded polysaccharides into oligosaccharides by extracellular enzymes, and the oligosaccharides were sequentially transported into the cell and then degraded into monosaccharides by intracellular enzymes. Oligosaccharide transport should play an important role in this process. However, there are few researches on oligosaccharide transporters as well as transcriptional regulation mechanism of polysaccharide utilization gene clusters. In this study, we plan to characterize three new oligosaccharide transporters encoded by xylan and mannan gene clusters, and study their roles in polysaccharide utilization. In addition, the transcriptional regulation mechanism of the mannan utilization gene cluster will be studied and the function of oligosaccharide transport in this process will also be evaluated. This research would help us identify new oligosaccharide transporters, get insight into their physiological function in hemicellulose utilization, and explore our understanding on hemicellulose utilization mechanism of bacteria.

嗜碱芽孢杆菌 N16-5 是一株半纤维素降解菌，前期研究中，我们通过转录组分析发现了该菌的木聚糖和甘露聚糖利用基因簇，并在基因簇上发现了寡糖转运蛋白和大量胞内水解酶。说明该菌很可能将多糖底物部分降解，以寡糖的形式转运进胞内，在胞内水解酶的作用下彻底降解为单糖后利用。因此，寡糖转运很可能在该菌的半纤维素利用中起到重要作用。目前，对细菌半纤维素利用的研究集中于多糖水解酶，而对寡糖转运蛋白生理功能的研究很少。本项目拟对嗜碱芽孢杆菌 N16-5 中发现的三个新的寡糖转运蛋白进行性质表征，并通过基因缺失研究它们对木聚糖、甘露聚糖利用过程产生的影响。同时，对甘露聚糖基因簇的调控方式进行深入研究，阐明寡糖转运在该基因簇调控中的作用。通过上述工作发掘新的寡糖转运蛋白资源，揭示寡糖转运在该菌半纤维素利用以及调控过程中的生理功能，同时深化我们对细菌半纤维素利用机制的认识。

研究微生物的半纤维素利用策略对解决木质纤维素中半纤维素组分的利用具有重要意义。以往这方面的研究多集中于半纤维素酶的发掘和性质表征，而寡糖转运在半纤维素利用过程中的生理作用和半纤维利用相关基因的转录调控方面的报道很少。嗜碱芽孢杆菌N16-5（Bacillus sp. N16-5）是一株半纤维素降解菌，能够高效利用木聚糖、甘露聚糖等底物。本课题以该菌为出发菌株对其寡糖转运体系和甘露聚糖利用转录调控进行了深入研究。在此过程中，发现了两个木寡糖转运蛋白底物结合蛋白XynE和AguE和一个甘露寡糖转运蛋白底物结合蛋白ManH。对XynE和AguE进行了单独敲除和共同敲除，证实AguE和XynE发挥协同作用促进木聚糖底物的利用。同时，本研究发现敲除ManH的编码基因将显著降低该菌对甘露聚糖的利用能力。经测定ManH对甘露寡糖有明显的结合能力，进一步证实ManH是一个甘露寡糖结合蛋白，其所属的ABC转运蛋白为甘露寡糖转运蛋白。此外，本研究对甘露聚糖利用基因簇的转录调控进行了研究，发现了新的甘露聚糖调控蛋白ManR。敲除ManR编码基因后甘露聚糖利用相关基因转录水平较野生株显著上调，说明ManR为负调控蛋白。研究进一步发现ManR的结合底物为甘露四糖和甘露五糖，而敲除ManH会导致甘露聚糖利用相关基因的转录下调，说明甘露寡糖在该菌甘露聚糖利用转录调控中发挥重要作用。本研究发掘了新的寡糖转运蛋白，揭示了嗜碱芽孢杆菌N16-5甘露聚糖利用的调控机制。帮助我们深入理解寡糖转运在细菌半纤维素利用和调控中的生理作用，同时为我们对工业菌株进行改造使其具备半纤维素及其降解产物的利用能力提供理论依据和基因资源。