长链非编码RNA HOXD-AS1促进人肝细胞癌增殖的作用及分子机制研究

It has been demonstrated that long noncoding RNA (lncRNA) play important roles in the occurrence and progression of hepatocellular carcinoma (HCC). Our previous study found HOXD-AS1, a lncRNA from HOXD loci, was highly expressed in hepatoma cells and its knockdown could inhibit the proliferation of HCC cells in vitro and cell cycle arrest at G2/M phase, implying that HOXD-AS1 may take part in proliferation of HCC. Based on our previous study, this project aims to clarify the role of HOXD-AS1 in HCC proliferation at the cellular, animal and clinical level by investigating the proliferation, cell cycle and tumor formation in nude mice of HCC cells that overexpress and knockdown HOXD-AS1 and examining the of HOXD-AS1 expression in HCC clinical samples and its relationship with clinicopathological characteristics, and to illustrate the molecular mechanism of promoting proliferation of hepatocellular carcinoma of HOXD-AS1 by identifying its binding protein and target genes and analyzing the mechanism of HOXD-AS1 regulating target genes through binding and related signaling pathway using RNA pull-down, RNA immunoprecipitation, microarray and ChIP-qPCR, etc. This project will provide new clues to revealing the molecular mechanism of pathogenesis and progression of HCC from the perspective of lncRNA, and will also offer the theoretical basis for clinical translational research of HOXD-AS1.

长链非编码RNA（lncRNA）作为新型调控分子可参与肝细胞癌（HCC）的发生发展。我们前期研究发现lncRNA HOXD-AS1在HCC细胞中高表达，其沉默后细胞增殖减缓且周期阻滞在G2/M期，提示HOXD-AS1可能参与调控HCC的增殖。本项目拟在前期基础上，通过观察HCC细胞过表达和沉默HOXD-AS1后细胞增殖、周期、裸鼠成瘤的变化情况并分析临床样本HOXD-AS1表达与HCC病理特征的相关性，从细胞、动物、临床水平明确HOXD-AS1在HCC细胞增殖中的作用；采用RNA pull-down、RNA免疫共沉淀、基因芯片、ChIP-qPCR等技术解析HOXD-AS1通过结合蛋白调控下游靶基因的作用机制及其调控的信号通路，进而阐明HOXD-AS1促进HCC增殖的分子机制，为从lncRNA角度揭示HCC发生发展的分子机制提供新线索，同时为HOXD-AS1应用于临床诊断治疗提供理论依据。

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）作为原发性肝癌的主要类型，是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展机制仍不明确。研究表明长链非编码RNA（lncRNA）作为新型调控分子可参与肝细胞癌（HCC）的发生发展。本研究发现一条来自人类染色体2q31.1区的一条lncRNA HOXD-AS1在HCC组织和细胞系中高表达且与病理分期显著正相关；通过功能缺失（Loss-of-function）实验发现HOXD-AS1沉默后，肝癌细胞Bel-7402和MHCC97H的增殖活性、迁移和侵袭能力受到显著抑制，同时可使肝癌细胞阻滞在G2/M和S期并诱导细胞发生凋亡；我们发现HOXD-AS1沉默可降低细胞周期蛋白Cyclin B1和Cyclin D1、抗凋亡蛋白BCL-2、基质金属蛋白酶MMP2的表达水平，同时提高促凋亡因子BAX的表达水平；通过转录组测序发现HOXD-AS1敲低后可显著影响1103个基因表达，其中132个差异表达基因（DEGs）与肝癌组织中HOXD-AS1的表达具有相关性； GO富集结果显示DEGs主要涉及细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移、血管新生和低氧反应等肿瘤相关生物学过程以及核小体组装、基因表达的表观调控等表观遗传学相关生物学过程；KEGG通路富集结果显示DEGs被显著富集于若干重要的肿瘤相关信号通路，包括NOD样受体、 P53、 TNF 和MAPK 信号通路并采用Western blot验证了HOXD-AS1敲低对肝癌细胞MEK/ERK 通路活性的抑制作用。此外，我们还发现HOXD-AS1可通过将表观调控因子WDR5招募至p21基因的启动子区域，增加H3K4me3修饰水平从而促进p21基因的转录，进而促进肝癌细胞增殖活性。总之，本研究提示HOXD-AS1可作为癌基因参与肝癌的发生发展，可作为潜在的肝癌诊断的标志物和治疗靶点。