生物多肽对绿脓杆菌性角膜炎的防治及其分子机制研究

细菌性角膜炎是最常见的致盲性眼病，尤以发病急剧、致盲率高的绿脓杆菌性角膜炎最为严重。目前对于绿脓杆菌与宿主间具体的相互作用机制，特别是作为致病首要步骤的绿脓杆菌粘附于角膜上皮细胞的过程研究得并不透彻。噬菌体展示技术是应用广泛的研究配体-受体相互作用的方法，利用此方法寻找已知受体的配基的模拟物，对研制生物技术新药有着重要的理论意义和应用价值。本实验室的前期研究已经利用噬菌体展示的12肽文库初步筛选出部分与人角膜上皮细胞相互作用的多肽，经同源分析发现其中有的与绿脓杆菌未知功能的膜蛋白同源，并预实验发现它们对绿脓杆菌粘附角膜上皮细胞的活性具有抑制作用。因此，本项目拟进一步研究此类多肽竞争性拮抗绿脓杆菌粘附角膜上皮细胞的活性；并通过构建对应膜相关蛋白的突变体，研究此蛋白在绿脓杆菌粘附宿主中的功能，为绿脓杆菌初期致病机制提供更丰富的理论基础，同时也为开创更好的绿脓杆菌性角膜炎的防治药物提供参考。

感染性角膜炎是最常见的致盲性眼病，特别是绿脓杆菌引发的角膜炎，发病迅速，炎症反应剧烈，一旦治疗不及时，很容易造成角膜穿孔。而目前治疗的主要方式是依赖于抗生素的药物治疗，但是随着耐药株的不断出现，抗生素治疗也面临重大挑战。由于对绿脓杆菌感染的发病机制还不十分清楚，所以也缺乏更安全有效的生物类药物的研发。粘附是病原微生物感染宿主细胞的首要的一步，如果能有效的阻断粘附，这也将会有效的阻止病原对宿主细胞的进一步感染。因此深入研究绿脓杆菌粘附宿主细胞的分子机制，寻找有效阻断绿脓杆菌粘附角膜细胞的因子，对于防治绿脓杆菌性角膜炎生物药物研发的靶标可以提供有着重要的参考价值。本研究前期通过噬菌体展示技术筛选到了14条多肽，随后对它们进行了生物信息学分析，发现其中发现Pc-B和 Pc-F两条多肽分别对应绿脓杆菌鞭毛钩状蛋白FlgE特定区段的氨基酸，另外Pc-E的后几个氨基酸也与绿脓杆菌一个未知功能的膜蛋白的特定区段有较高同源性。我们随后对Pc-B和 Pc-E以及未知功能膜蛋白（HmpA）的相应氨基酸区段（Pc-EP）进行合成，发现三条多肽都可与角膜上皮细胞结合，而且都能一定程度的刺激HCEC表达炎性因子。通过构建flgE和hmpA的多肽对应区段的突变株，我们发现基因突变后，绿脓杆菌相对于野生株对HCEC的粘附能力明显下降，而且合成的多肽可以抑制野生型的绿脓杆菌粘附HCEC却不能抑制突变株，说明多肽对应位置是绿脓杆菌粘附HCEC的有效结构域。同时我们也评价了三条多肽用于防治绿脓杆菌性角膜炎的效果，发现感染前后多肽的处理确实可以一定程度的阻止绿脓杆菌行角膜炎的发展。最后我们通过Pull-down的方法研究了FlgE在宿主细胞中可能的受体，发现细胞表面的小凹蛋白或许是FlgE的一个受体，另外ATP合成酶可能与FlagE存在较强的相互作用，促进了线粒体介导的细胞凋亡。这些蛋白介导宿主细胞免疫反应的研究正在进行中。.受到本课题的资助共发表SCI文章8篇，中华牌杂志文章3篇；申请国家发明专利4项，已授权3项；课题负责人由于感染性角膜病的研究获得山东省科学技术进步一等奖1项（第七完成人），医学科学院科学技术进步二等奖和青岛市科学技术进步二等奖各1项（均为第二完成人）。