TPA联合Imatinib治疗慢性粒细胞白血病的实验研究

分离Flk1+Scl+CD31-CD34-慢性粒细胞白血病肿瘤干细胞(慢粒白血病干细胞)，采用流式细胞分选技术将其分为G0、G1和S/G2+M三个细胞亚群，体内外分别检测其慢粒白血病干细胞特性及对Imatinb的敏感性；在此基础上，体内外分别探讨氟波酯（TPA）间接增强Imatinib靶向清除慢粒白血病干细胞的可能性，并利用流式细胞术、实时荧光定量PCR、功能分类基因芯片等研究手段探讨其作用机制。本项目旨在通过深入把握慢粒白血病干细胞的生物学特性，初步揭示其产生临床耐药的本质；初步探讨调节慢粒白血病干细胞分化、凋亡或死亡的关键基因及关键信号分子，为探索Imatinib联合其他药物克服耐药提供切入点。借助TPA间接增强Imatinib对慢粒白血病干细胞的敏感性，提高利用常规剂量Imatinib治疗慢性粒细胞白血病（尤其是处于加速期或急变期的慢性粒细胞白血病）的疗效，在一定程度上克服药物抗性。

酪氨酸激酶靶向抑制剂伊马替尼（Imatinib mesylate）能有效治疗慢性粒细胞白血病（CML），但其却很难彻底清除CML患者体内BCR-ABL+、处于细胞周期静止期的白血病干细胞。而CML患者体内持续存在的少量、但在分子水平可检测到的白血病干细胞，无疑可能会成为疾病复发及产生对Imatinib mesylate耐药的突变白血病细胞的潜在源泉。本研究首先从CML患者骨髓细胞中分离Flk1+Scl+CD31-CD34-慢性粒细胞白血病肿瘤干细胞(慢粒白血病干细胞)，采用流式细胞分选技术将其分为G0、G1和S/G2+M三个细胞亚群，体内外分别检测其慢粒白血病干细胞特性及对Imatinib mesylate的敏感性；在此基础上，体内外分别探讨氟波酯（TPA）间接增强Imatinib mesylate靶向清除慢粒白血病干细胞的可能性并初步探讨了其分子机制。结果发现：浓度为5μM的 Imatinib mesylate，维持作用96小时（病人体内维持96小时的Imatinib mesylate浓度只可能达到1-2μM），即可有效抑制定向造血祖细胞的增殖；没有充分的证据显示，浓度为5μM的 Imatinib mesylate对BCR/ABL融合基因阳性、免疫表型为Flk1+CD31-CD34-细胞的分化及增殖具有明显的抑制作用；TPA（间断给药方式）能有效诱导处于细胞周期静止期（G0期）的Flk1+Scl+CD31-CD34-细胞进入分化周期；TPA联合伊马替尼体外能显著诱导BCR/ABL+Flk1+CD34-细胞（包括处于GO期、G1期及S/G2 + M细胞）凋亡；TPA联合伊马替尼体内可有效提高伊马替尼的疗效。综上,可得出以下结论：CML患者体内的原始白血病干细胞对Imatinib mesylate具有一定的抗性, 临床上所观察到的CML患者在运用Imatinib mesylate一段时间后出现正常的造血恢复现象，可能仅仅是因为Imatinib mesylate清除了定向恶性白血病祖细胞的增殖，在经历了短暂的血液学甚至是细胞遗传学水平上的缓解后，对Imatinib mesylate耐药、处于静止期的原始白血病干细胞终究会再次导致CML的复发;TPA联合Imatinib mesylate可有效诱导原始白血病干细胞的凋亡，其机制可能在于TPA首先显著诱导白血病干细胞分化。