MST1R基因调控AKT信号通路在法洛四联症发生中的作用及分子机制

Tetralogy of Fallot (TOF) is a birth defect caused by abnormal cardiac development in the embryonic stage, and its pathogenesis is unknown. In our previous studies, the mutations in the MST1R gene were identified in the TOF family and sporadic cases and its expression showed down-regulated in the tissue of TOF case. Moreover, MST1R was predicted to influence the activity of AKT signaling pathway which plays an important role in fetal heart development. Thus, we assume that the abnormality of MST1R and its mediated AKT signal pathway may be involved in the pathogenesis of TOF. This study is intended to complete the following parts: .1. To investigate the DNA sequence, expression and regulation mechanism of MST1R gene in TOF patients and determine the correlation between genetic abnormalities and TOF disease; .2. To study the effects of MST1R gene mutations on hiPSCs pluripotent, directional cardiomyocyte differentiation, morphology and function, and analyze the downstream interacting proteins of the MST1R gene for clarifying the its mediated mechanism in AKT signaling pathway;.3. Using the zebrafish and mouse model to observe the effects of MST1R gene mutations on the cardiac phenotype and AKT signaling pathway activity and elucidate the mechanism of the gene mutations causing cardiac dysplasia. These results provide a scientific basis for elucidating the pathogenesis of TOF.

法洛四联症（TOF）是胚胎期心脏发育异常引起的出生缺陷，其发病机制不明。课题组前期研究发现，MST1R基因在TOF家系和散发性病例中发生突变且在病例组织中表达下调。研究提示MST1R能够调控AKT信号通路活性，而该信号通路在胎儿心脏发育中起重要作用，因此，我们提出MST1R及其介导的AKT信号通路异常是TOF发生重要因素假说，本研究拟完成：1 分析TOF病例中MST1R基因DNA序列变化，蛋白表达及调控机制，确定基因异常与TOF发生相关性；2 建立TOF患者来源hiPSCs，检测MST1R基因突变对hiPSCs多能性、定向心肌细胞分化、形态和功能等影响，分析其下游相互作用蛋白，明确其调控AKT信号通路的作用机制；3 在斑马鱼和小鼠模型中观察MST1R基因突变对心脏表型和AKT信号通路活性影响，明确该基因突变导致心脏发育异常的机制；研究结果为阐明TOF的发病机制提供科学依据。

法洛四联症（TOF）是一种比较严重紫绀型先天性心脏病，其发病机制不明。本项目前期通过二代测序发现TOF家系中MST1R基因存在隐性纯合突变c.T2009G: p.V670G以及罕见突变c.A2194T: p.S432C，拟进一步通过人胚胎干细胞和小鼠进行整体观察，阐明MST1R及其突变对心脏发育的影响及分子机制。项目的主要研究内容包括：（1）扩大先心病样本量，针对MST1R基因进行靶向测序从而发现更多突变位点；（2）建立MST1R点突变人心肌细胞系AC16初步探讨MST1R基因突变生物学功能差异；（3）构建MST1R敲除人源干细胞细胞系，研究MST1R基因在心血管定向分化中的作用；（4）建立Mst1r基因敲除小鼠模型，探究Mst1r基因在心脏发育过程中的作用。本研究主要发现如下：（1）在扩大的1155例散发性先心病患儿中发现32例患儿携带MST1R致病性突变，400位正常对照中发现两位孩子携带突变，Fisher检验提示MST1R基因的突变是先天心脏病发生的重要风险因素；（2）发现建立的MST1R突变的AC16心肌细胞和HEK293T工具细胞发生了明显的“S”期阻滞，细胞的增殖能力受到抑制；（3）MST1R基因在正常干细胞心血管定向分化过程中的表达特点与心脏基因类似，且MST1R敲除后的OCT4，NANOG，KLF4多能性基因未发生明显变化，提示干性未发生明显影响，可以进行心肌细胞定向分化；在分化过程中，基因敲除后的细胞中ISL1，GATA4，NKX2-5心脏前体细胞marker以及TNNT2成熟心肌细胞关键心脏基因发生明显的降低，BNP，MYH6，MYL2等心肌细胞肌节以及RYR2，CACNA1C等钙离子通路相关基因出现异常，提示MST1R基因参与了心肌细胞定向分化过程；（4）发现Mst1r基因敲除鼠心脏收缩功能以及血流学动力学出现了异常；转录组测序发现差异基因富集的通路多为骨骼发育，心脏血液循环相关，提示Mst1r下游激活胚胎发育通路，与胚胎发育相关。这些研究结果证明了我们的假说，既MST1R基因异常通过参与调控心脏的发育，导致先天性心脏病的发生。本课题从临床样本出发，结合基础研究，从遗传学和功能学层面阐明了MST1R基因异常对心脏发育的影响，为TOF以及重症先心病的早期诊断防治提供理论依据。