法洛四联症NOTCH信号通路候选基因甲基化修饰异常的鉴定及机制研究

Tetralogy of Fallot (TOF) is a multigenic disease caused by abnormal development of second heart field (SHF) during embryonic period, but its pathogenesis remains unclear so far. Studies have found that, in the TOF cases, the candidate genes of NOTCH signaling pathway maintaing the normal development of SHF showed abnormal expression and lower mutation rate, considering the environment influences, we hypothesized that DNA methylation maybe participate in the expression regulation of candidate genes. In this study, in order to explore the role and molecular mechanism of candidate gene methylation aberrant in the TOF development，the study contents are as follows: .1. Analyzing the promoter methylation status of candidate genes and their expression in the tissue samples. Based on the basic and clinical date from study, determing the correlation between the gene methylation and their expression and establishing an epigenetic forecasting index for TOF risk;.2. Exploring the influence of abnormal methylation region and its related transcription factors on the candidate gene activity, elucidating the molecular mechanism of gene expression regulation of signaling pathway by the abnormal methylation modification；.3. Downregulating the expression of candidate genes in the zebra fish model and observing their influences on the activity of downstream genes in the NOTCH signaling pathway and heart development..The results of the study are expected to establish an epigenetic forecasting index for TOF risk and provide a theoretical basis for the research on epigenetic regulation and etiology of TOF diseases.

法洛四联症（TOF）是胚胎期心脏第二心区(SHF)发育异常引起的多基因疾病，其发病机制不明。本课题组前期研究发现，维持SHF正常发育的NOTCH信号通路候选基因（NOTCH4，DLL1，DLK1，HES1，HEY2）在TOF病例组织中表达下调且基因突变率很低，考虑到环境因素影响，推测DNA甲基化修饰异常是引起基因下调的重要因素，在本研究中，为了明确候选基因甲基化调控的作用机制，拟完成：1分析候选基因启动子甲基化状态和基因表达情况，结合基础和临床资料，确定甲基化修饰和基因表达相关性及在疾病发生风险预测方面的意义；2分析候选基因甲基化异常区域及与之结合的转录因子与基因转录关系，探讨甲基化修饰对基因表达调控的分子机制；3在斑马鱼模型中，观察候选基因下调对NOTCH信号通路及心脏发育的影响；研究结果有望建立TOF发病风险表观遗传预测指标，为阐明TOF发生的表观遗传调控机制和病因研究提供理论依据。

NOTCH信号通路具有高度保守性，调控细胞增殖、分化和凋亡的功能，几乎涉及所有组织和器官。在心脏胚胎发育期，NOTCH信号通路参与心脏房室管、瓣膜、流出道及肌小梁的形成过程，在维持胚胎期心脏第二心区(SHF)正常发育过程中起重要作用。法洛四联症（TOF）是胚胎期心脏第二心区(SHF)发育异常引起的多基因疾病，其发病机制不明。本课题组针对NOTCH信号通路候选基因（NOTCH4，DLL1，DLK1，HES1，HEY2）在TOF病例组织中表达下调且基因突变率很低问题，考虑到环境因素影响，推测DNA甲基化修饰异常是引起基因下调的重要因素，本项目的主要研究内容包括：1分析候选基因启动子甲基化状态和基因表达情况，结合基础和临床资料，确定甲基化修饰和基因表达相关性及在疾病发生风险预测方面的意义；2分析候选基因甲基化异常区域及与之结合的转录因子与基因转录关系，探讨甲基化修饰对基因表达调控的分子机制；3在斑马鱼模型中，观察候选基因下调对NOTCH信号通路及心脏发育的影响。本项目在扩大的TOF心肌组织样本和正常对照心肌组织样本中，通过免疫组化证实NOTCH信号通路候选基因（NOTCH4，DLL1，DLK1）的表达在病例组织中明显降低，HES1基因表达上调，而HEY2基因免疫组化结果差异不明显。我们利用BSP方法检测基因启动子甲基化状态分析，发现NOTCH4，DLL1，DLK1基因启动子甲基化显著异常且与相应的基因表达具有显著相关性。为了明确甲基化调控的分子机制，研究发现NOTCH4，DLL1，DLK1基因启动子甲基化异常影响了相应的转录因子ETS1，p53，RXRα的结合，进而影响基因的表达；在基因启动子区甲基化分析过程中，我们并没有发现HES1基因启动子区甲基化异常，通过启动子区测序发现TOF病例样本中有一个插入突变，该突变与疾病的发生风险显著相关，机制研究发现，该突变阻碍了转录因子RXRα在基因启动子区的结合，导致基因的转录活性明显降低；此外，本研究对TOF病例中ZFPM2、TBX20和NR2F2等表达下调基因的机制进行研究，发现DNA甲基化异常是引起这些基因下调的重要表观遗传因素。本课题从临床问题出发，结合基础研究，从表观遗传角度证实了NOTCH信号通路候选基因异常的表观调控机制，为阐明TOF发生的表观遗传调控机制和病因研究提供理论依据。