同型半胱氨酸对内皮细胞中可溶性表氧化物水解酶的转录调控机制研究

Hyperhomocysteinemia (HHcy) causes vascular endothelial disfunction,which participates in the development of atherosclerosis and other vascular diseases. The involved mechanisms include DNA methylation, endoplasmic reticulum (ER) stress and oxidative stress. Soluble epoxide hydrolase (sEH) is a major enzyme to hydrolyze epoxyeicosatrienoic acids and attenuate their cardiovascular protective effects. Our previous study revealed that homocysteine(Hcy) transcriptionally upregulated sEH expression, decreased EETs content and leaded to endothelial activation. This study carries out the model of endothelium dysfunction through Hcy-stimulated human umbilical vein endothelial cells，actually or chronically, and established HHcy mice. We are aimed to explore the detail sEH regulated mechanisms by Hcy, including DNA methylated modification and ER stress and their cross-talk using bioinformatics, epigentics and molucular biology technologies. We will define the binding sites of activating transcription factor-6 (ATF6) on the promoter of sEH specifically under the affection of Hcy induced DNA hypomethylation modification and ER stress,especially ATF6 nuclear translocation. Discovery the precise mechanism underlying Hcy-upregulated sEH may be provide a novel theoretical basis and specific therapeutic targets for Hcy-associated endothelial activation and atherogenesis.

高同型半胱氨酸血症可介导血管内皮细胞功能紊乱而启动动脉粥样硬化发生，其机制包括表观遗传学修饰，内质网应激和氧化应激等。可溶性表氧化物水解酶(sEH)可将花生四烯酸代谢产物表氧-二十碳三烯酸(EETs)水解为无活性的代谢物，从而失去其心血管保护作用。我们前期研究证实，同型半胱氨酸(Hcy)可转录性上调sEH表达，降低EETs含量，参与内皮细胞的激活反应。本研究拟利用Hcy急/慢刺激原代人脐静脉内皮细胞功能紊乱和相应的高同型半胱氨酸血症C57小鼠为模型，采用生物信息学、表观遗传学和多种分子生物学技术，从DNA甲基化修饰和内质网应激的相互作用，探讨Hcy介导的sEH基因启动子区活化转录因子6(ATF6)结合位点的甲基化修饰反应与内质网应激，特别是ATF6剪切/入核反应，对sEH基因转录表达的影响。明确Hcy对sEH转录调控机制和位点，以期为Hcy导致动脉粥样硬化发病提供新的理论基础和治疗途径。

研究背景：同型半胱氨酸 (homocysteine, Hcy）是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS) 独立的危险因子。血管内皮的激活和功能紊乱是Hcy引起的AS病理生理过程中的首要环节，然而其机制尚不清楚。表氧-二十碳三烯酸 (epoxyeicosatrienoic acids, EETs) 是花生四烯酸经P450通路的代谢产物，被认为是内皮衍生性超极化因子，发挥心血管保护作用。可溶性表氧化物水解酶 (soluble epoxide hydrolase, sEH)可通过催化水解反应将EETs转变为相应二羟-二十碳三烯酸，使EETs丧失其生物活性。.主要研究内容和结果：本研究以原代人血管内皮细胞和高同型半胱氨酸血症小鼠模型为研究对象，采用定量PCR、western blot、免疫组化、免疫荧光、报告基因检测、亚硫酸氢盐测序、染色质免疫共沉和腺病毒扩增感染等手段，首次发现：1). 同型半胱氨酸以剂量和时间依赖性的上调人血管内皮细胞中可溶性表氧化物的表达，并导致内皮细胞活化，sEH抑制剂可以阻滞Hcy导致的内皮活化作用；2). Hcy首先诱导内皮细胞中的内质网应激反应，使内质网应激信号传导分子ATF6剪切活化、入核，并与sEH启动子上ATF6结合位点相结合，从而转录性上调sEH；同时，Hcy促使sEH启动子上ATF6结合位点发生去甲基化反应，增加ATF6与sEH启动子的结合活性并上调sEH表达；3). 高蛋氨酸喂养可升高C57小鼠体内血清总Hcy水平，诱导内质网应激反应并启动sEH启动子上ATF6结合位点去甲基化反应，增加主动脉内膜中sEH和细胞激活反应；4). sEH抑制剂或sEH基因敲除可以减弱高同型半胱氨酸血症中的血管内皮激活反应。5). Hcy通过DNA甲基化作用转录性上调sEH的这一机制，可以应用到Hcy降低hTERT的表达，加速内管内皮端粒缩短和衰老的过程中。6). CYP450-EETs-sEH通路同样参与到乳腺癌的发展过程中。.科学意义：本课题首次在体内和体外发现Hcy可以影响花生四烯酸代谢的CYP450-EETs-sEH通路而参与血管内皮细胞的功能紊乱，而sEH特异性抑制剂可以有效阻滞由Hcy引起的内皮细胞损伤和衰老反应。我们的探索为理解Hcy在动脉粥样硬化发生发展中的病理生理作用提供了新的理论依据，为进一步揭示动脉粥样硬化的发病机制和