禽白血病病毒衣壳蛋白诱导Wnt/β-catenin信号通路活化参与肿瘤形成的作用与机制

Abnormal activation or expression of the Wnt pathway often leads to cellular malignant transformation and tumorigenesis. Avian leukosis virus can induce a spectrum of different neoplasms in clinic. However, the role of Wnt signaling pathway in the oncogenesis of avian leukosis virus remains to be addressed. According to our previous study, we found that the overexpression of caspid protein p27 of subgroup J avian leukosis virus could cause abnormal expression of LEF, Cyclin D1, VEGF, c-Myc and other molecules associated with Wnt/β-catenin signaling pathway. The process suggests that p27 protein might get involved in the occurrence and development of tumor by activating the the Wnt/β-catenin signaling pathway that leading to cell proliferation and apoptosis imbalance. This research project will study how the p27 protein regulate the activation of Wnt/β-catenin signaling pathway and the expression of downstream genes by lentiviral vector and double luciferase reporter gene system. And we will try to clarify the function and mechanism of p27 protein involved in the process of tumor development. The expected research results will make a new theoretical basis for a comprehensive understanding of the tumorigenesis mechanism of avian leukosis virus, and provide a new target for the prevention and control of avian leukosis diseases. Moreover, it has important scientific significance especially in the mechanism study of virus-induced tumorigenesis.

Wnt途径的异常激活或异常表达常导致细胞恶性转变和肿瘤发生。禽白血病病毒能够引起禽类多种肿瘤性疾病，Wnt途径在禽白血病病毒致瘤中的作用尚不清楚。课题组前期研究发现，过表达J亚群禽白血病病毒编码的p27衣壳蛋白能引起Wnt/β-catenin信号通路LEF、Cyclin D1、VEGF、c-Myc等相关分子的异常表达，提示p27蛋白可能通过活化Wnt/β-catenin 信号通路导致细胞增殖与凋亡平衡失调，参与肿瘤的发生发展。本项目拟利用慢病毒载体、双荧光素酶报告基因系统等，研究p27蛋白调控Wnt/β-catenin信号通路的活化以及下游基因的转录和表达变化，进而明确p27蛋白参与肿瘤发生发展的功能与机制。本项目的研究结果为全面了解禽白血病病毒感染致瘤的机制提供新的理论依据，也为预防与控制禽白血病提供新的靶标，特别是在病毒诱导肿瘤发生的机制方面有重要的科学意义。

课题组前期研究结果表明，禽白血病病毒感染致病过程中，鸡体内的Wnt/β-catenin信号通路发生异常的变化。因此，推测Wnt/β-catenin信号通路在禽白血病病毒感染与致病过程中发挥重要作用。基于前期研究结果课题组经过4年的研究明确了禽白血病病毒与Wnt/β-catenin信号通路的相互关系，并鉴定了病毒编码蛋白对宿主细胞中Wnt/β-catenin信号通路及细胞周期的影响，进一步解释了禽白血病病毒感染致病的机制，为防控疫病的流行提供了新的理论依据。项目主要研究结果如下：1. 制备并获得特异性β-catenin抗体，检测家禽不同细胞中的β-catenin蛋白的细胞定位，基因表达量以及蛋白表达量，发现CEF细胞正常状态下β-catenin基因和蛋白表达基础水平最低。研究结果表明，CEF细胞具有较低的Wnt信号通路基础活化状态，对信号通路激活剂反应显著，是研究家禽Wnt信号通路良好的细胞模型，有利于进一步深入研究Wnt信号通路在家禽疾病中的作用及其机制。2. 信号通路激活剂GSK-3 inhibitor X处理细胞后感染ALV-J，随着GSK-3 inhibitor X剂量的增加，病毒增殖加快。实验结果表明Wnt/ GSK-3/β-catenin信号传导通路激活与细胞周期相关的靶基因（例如c-Myc和cyclin D）的转录上调促进G1/S过渡，使细胞DNA复制增加，从而促进了病毒的复制。同样，信号通路抑制剂iCRT14在CEF细胞、LMH细胞、CEK细胞中均可有效的抑制β-catenin的表达，同时抑制Wnt信号通路，使病毒复制显著降低。因此，Wnt/β-catenin的活化状态与ALV-J病毒复制呈正相关。3. 构建GY03病毒编码蛋白，转染细胞后结果显示P27可引起通路下游重要转录因子β-catenin的升高，提示P27蛋白可能激活信号通路，P2、P12、P15、Gp37下调β-catenin的表达，提示可能抑制信号通路的活化。P12、P15可降低TCF-4、AXIN和c-myc的表达。流式细胞结果显示P27可使CEF细胞在G2期和S期的比例增多，提示在此期间有利于病毒的复制。以上研究结果为全面揭示ALV-J致病与致肿瘤机制提供了新的理论依据。