谷氨酸棒杆菌高产甲硫氨酸关键酶抗反馈作用机制研究

Methionine is one of the essential amino acids required in diet of human and livestock. Corynebacterium glutamicum has much simpler regulatory mechanisms for methionine production, providing convenience for methionine production using metabolic engineering. However,methionine yield is still low due to feedback inhibition on homserine acetyltransferase and O-acetylhomoserine sulfhydrylase, molecular methanism of methionine inhibition is unclear. In this study, we will use random mutation research methods to gain feedback resistant of two key enzyme mutants. We will character the enzymatic properties, temperature and pH stability, kinetic constants, methionine enzyme activity changes under high concentration of methionine. We will analysis anti-feedback mechanism using homology modeling, providing theoretical basis for the rational tranformation of the two key enzymes.Finally,mutants will be overexpression in methionine production strains, improving the yield of methionine, providing a theoretical basis for methionine production.

甲硫氨酸是人体和动物营养一种重要的限制性必需氨基酸。谷氨酸棒杆菌合成甲硫氨酸的代谢途径反馈调节相对简单，可以通过代谢工程手段改造生产甲硫氨酸。但是由于甲硫氨酸对高丝氨酸乙酰转移酶和O-乙酰高丝氨酸巯解酶反馈抑制导致甲硫氨酸产量一直偏低。有关甲硫氨酸对这两个关键酶反馈抑制的分子机制尚不明确。本项目拟通过随机突变的研究策略，在甲硫氨酸存在条件下筛选具有抗反馈抑制的两种关键酶突变体；通过对突变体的温度和pH稳定性，动力学常数以及在高浓度甲硫氨酸条件下的酶活变化等进行分析确定抗反馈突变体的酶学特性；通过对突变体进行同源建模分析突变位点与抗反馈之间的关系，解析其抗反馈机理，为理性改造提供理论指导。最后将突变体转入谷氨酸棒杆菌甲硫氨酸生产菌中，从而提高由高丝氨酸到甲硫氨酸的代谢流，进而提高甲硫氨酸的产量，为实现工业化生产甲硫氨酸提供理论基础。

甲硫氨酸是人体必需的氨基酸之一，也是动物营养中一种重要的限制性必需氨基酸。目前甲硫氨酸主要是化学合成或蛋白水解所得，但只能得到DL-型混旋甲硫氨酸，而通过微生物发酵法可以直接合成L-型甲硫氨酸，其相对生物利用率比DL-型甲硫氨酸高出20-40%。目前可应用于生产甲硫氨酸的菌株有大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。与大肠杆菌相比，谷氨酸棒杆菌中甲硫氨酸反馈调控相对简单，故其成为甲硫氨酸生产菌株的主要研究对象。虽然通过代谢工程改造谷氨酸棒杆菌可以合成一定量的甲硫氨酸，但是目前其甲硫氨酸的产量未达到工业化生产的要求。因此，探究谷氨酸棒杆菌中甲硫氨酸合成途径中关键限速酶的酶学性质，阐明谷氨酸棒杆菌在甲硫氨酸生产过程中甲硫氨酸反馈抑制调节机制至关重要。首先对不同来源的高丝氨酸乙酰转移酶进行了同源比对。通过同源比对和建模分析得出高丝氨酸乙酰转移酶含有11个α螺旋和6个β折叠。折叠区β3-β4连接环的构象可能决定了底物结合亲和力。在对两种不同来源的高丝氨酸乙酰转移酶进行酶促反应是发现，梅耶里钩端螺旋体梭菌来源比谷氨酸棒杆菌来源的高丝氨酸乙酰转移酶比活力的高2.32倍。在进化守恒分析和结构导向工程的基础上，将蛋白质工程应用于提高高丝氨酸乙酰转移酶（MetXlm）的酶学性质。由此产生的MetXlm的三个F147L-M182I-M240A突变体的比活力增加了12.15倍，优化表达的MetXlm突变体使OAH产量提高了57.14%。将F147L-M182I-M240A突变体在先前构建的甲硫氨酸生产菌HW104中，甲硫氨酸产量显著提高。经过发酵培养基的优化处理，重组菌摇瓶发酵甲硫氨酸产量提高到4.10g/L，分批补料发酵甲硫氨酸产量可提高到10.64g/L。通过本项目的研究阐明了谷氨酸棒杆菌甲硫氨酸合成路径上的关键限速步骤并对关键酶进行了抗反馈抑制改造，有利于提高终产物甲硫氨酸的产量。后期通过进一步的改造可以将谷氨酸棒杆菌改造为可工业化生产甲硫氨酸的菌株。