Rbp-j/MicroRNA-342-5p/Glast通路调控肛门直肠畸形胎鼠腰骶髓发育的机制研究

The maldevelpopment of lumbosacral spinal cord in anorectal malformations (ARMs) plays a major role in the postoperative bowel dysfunction. Our preliminary studies revealed that the expression transcription factor Rbp-j decreased and the level of miR-342-5p increased in the ARMs fetuses by using RNA-seq. In addition, Rbp-j is predicted as a putative transcriptional regulator for miR-342-5p.We also identified glutamate aspartate transporter（Glast）as a new novel target gene of miR-342-5p. Based on our findings, we hypothesized that decreased Rbp-j suppressed Glast through regulating miR-342-5p, which destroyed the balance of glutamate aspartate transport and induce abnormal proliferation, differentiation and apoptosis, inducing to lumbosacral spinal cord dysplasia in ARMs fetuses. In the current study, we employ an ETU-induced ARMs rat model as well as Rbp-j transgenic rat model to investigate the relationship of Rbp-j/miR-342-5p/Glast, demonstrating the function and mechanism of this axis in proliferation, differentiation and apoptosis of lumbosacral spinal cord in ARMs. This project will provide scientific evidence for understanding for pathogenesis and new therapeutic treatments of lumbosacral spinal cord dysplasia in ARMs.

腰骶髓发育异常是先天性肛门直肠畸形(ARMs)术后排便功能障碍的重要原因之一。课题组前期利用RNA-seq筛选到了转录因子Rbp-j及miR-342-5p在ARMs胎鼠腰骶髓中表达异常，预测发现Rbp-j是miR-342-5p的转录调节子。并且我们证明了miR-342-5p的一个新的靶基因，谷氨酸天冬氨酸转运体Glast。因此我们推测，下调的Rbp-j通过调节miR-342-5p转录，进而抑制Glast表达，破坏神经细胞间谷氨酸转运平衡而引起细胞的增殖、分化和凋亡异常，导致腰骶髓发育不良。本研究拟以Rbp-j/miR-342-5p/GLAST为主轴，利用乙烯硫脲致畸的ARMs大鼠模型以及Rbp-j转基因鼠，研究此通路各个因子间的调节关系，明确他们对细胞增殖、分化和凋亡的影响，为揭示ARMs胎鼠腰骶髓发育不良的机制提供重要的研究基础，并为临床治疗寻找新的干预靶点提供新思路。

先天性肛门直肠畸形是由是最常见的小儿消化道畸形，病理改变复杂，患儿术后存在不同程度的便失禁和便秘等排便功能障碍，需要终生治疗，阐明肛门直肠畸形的病理改变机制具有极其重要的意义。本课题利用乙烯硫脲致畸建立了肛门直肠畸形胎鼠模型，对肛门直肠畸形的相关致病分子机制进行深入探讨。为探讨肛门直肠畸形胎鼠腰骶段脊髓组织中的全转录组表达差异，对胚胎17天的全转录组信息进行了生物信息分析，并验证差异基因在腰骶段脊髓中的表达情况。采用免疫组化染色、qRT-PCR和Western blot分析胚胎第16、17、19和21天Bmp7和notch1的表达情况，结果显示Bmp7和Notch1的mRNA和蛋白表达下调，且在肛门直肠畸形胎鼠腰骶脊髓背角的中间神经元中表达明显降低。利用免疫荧光双染色和western blot检测Bmp7和notch1表达高峰时神经元标志物神经丝(NF)与pSmad1/5或重组信号结合蛋白- j蛋白（Rbp-J）的表达，结果显示pSmad1/5及Rbp-J降低。本研究提示Bmp7和Notch1.的下调可能在肛门直肠畸形胎鼠发育过程中导致腰骶脊髓发育不良，提示Bmp7和Notch1.的可能在肛门直肠畸形术后排便功能障碍的发病机制及其并发症中发挥重要作用。本课题研究发现rno_circ_0004002的沉默与抑制增殖、促进细胞凋亡和上皮-间质转化（EMT）有关。利用荧光素酶报告试验和干预试验证明rno_circ_0004002是miR-342-5p的海绵体，而miR-342-5p可以靶向Wnt3a的3'-UTR，对其表达进行负向调节。拯救试验显示，miR-342-5p抑制剂可以逆转rno_circ_0004002敲除对肛门直肠发育的抑制作用。我们的研究揭示了rno_circ_0004002通过海绵化miR-342-5p在细胞增殖、凋亡和EMT中的调控机制，它下调了Wnt3a在肛肠发育中的表达，rno_circ_0004002/miR-342-5p/Wnt3a可能成为肛门直肠畸形潜在的治疗靶分子。本课题的研究已发表标注课题资助的论文5篇，其中SCI收录4篇。本课题培养2名硕士研究生。