多形汉逊酵母甲醇代谢分子机理研究

Bio-transformation of methanol, an important one-carbon compound, will provide a clean process for coal utilization and the efficient production of vital energy products and fine chemicals. Non-conventional methylotrophic yeast, Hansenula polymorpha, has been generated as the fine host strain for protein expression and lignocellulosic ethanol production due to its thermo-tolerance and natural xylose assimilation. However, a systematic research on the characteristics of methanol metabolism by H. polymorpha has not been proposed, which blocks its promotion of effective methanol biotransformation. Therefore, this project will systematically investigate the molecular mechanisms on methanol metabolism in H. polymorpha with the aid of the construction of its genetic manipulation platform. On the one hand, the global transcriptional analysis will be carried out to deeply mine key elements related to methanol metabolism (Top-Down pipeline); on the other hand, engineered methanol-utilizing Saccharomyces cerevisiae will be constructed and optimized to evaluate functions and suitabilities of elements related to methanol metabolism from H. polymorpha (Bottom-Up pipeline). Finally, methanol assimilation efficiency of H. polymorpha will be strengthened and optimized by using fatty acids as the target products. In general, this study may lay a good foundation for the regulation and improvement of natural methanol metabolism pathways, which will eventually achieve the methanol-based economy in the near future.

甲醇是重要的一碳化合物，建立甲醇生物转化过程将会促进我国煤炭资源洁净利用，实现重要能源产品和精细化学品的可持续性生产。多形汉逊酵母作为非传统甲基营养型酵母，以其耐高温和天然利用木糖等特性，成为蛋白表达以及纤维素乙醇发酵的优良宿主。然而其甲醇代谢特性还没有得到系统研究，阻碍了对其高效甲醇转化过程的改造与强化。因此，本项目计划从构建汉逊酵母的基因操作平台出发，系统探究汉逊酵母甲醇代谢的分子机理。从全局转录组学的角度，深入挖掘甲醇代谢关键基因与调控元件。在此基础上，构建甲醇利用型酿酒酵母，评价汉逊酵母甲醇代谢相关元件功能与适配规律。最终，以脂肪酸为指标，强化汉逊酵母甲醇代谢过程。本研究成果将为天然甲醇同化通道的调控与改造奠定基础，也为实现基于甲醇的经济生产模式提供理论支持及技术保证。

甲醇是重要的一碳化合物，其原料来源广泛、价格低廉且稳定，液体特性能够与现有设备对接，以甲醇作为生物炼制原料能够有效缓解资源短缺和环境污染等问题。但是，甲醇代谢复杂，特别是其中间代谢物甲醛具有毒性，因此，研究甲醇代谢相关分子机制能够推动甲醇生物转化的研究进展。本项目拟在天然甲基营养型多形汉逊酵母中探究甲醇代谢分子机制，并以脂肪酸为指标，结合经典代谢工程与组学分析，解析甲醇代谢关键基因靶点，并探究汉逊酵母作为细胞工厂的应用潜力。.本项目执行过程中，首先，建立了基于CRISPR/Cas9体系的精准基因组编辑系统，该系统具有高编辑效率、高同源重组效率并且操作简便；在此基础上，以葡萄糖为底物，构建了汉逊酵母高产脂肪酸细胞工厂并评价了相关代谢工程改造策略，脂肪酸产量达到32 g/L；但是，当以甲醇为底物时，高产脂肪酸汉逊酵母无法生长。因此，我们调整了部分研究方向，主要集中于解决汉逊酵母本身甲醇代谢关键问题，解析了生物合成过程中甲醇代谢的毒性分子机制。最终，借助实验室适应性进化、基因组与转录组测序分析以及反向代谢工程等手段，鉴定了系列与甲醇代谢相关的关键基因与代谢途径，同时发现了Rim101途径介导的细胞坏死过程调控了汉逊酵母的甲醇代谢，使得汉逊酵母以甲醇为唯一碳源时脂肪酸产量达到了15.9 g/L。.本项目的执行，开启了甲醇生物转化研究的全新领域，缓解生物合成过程中的甲醇毒性将极大提高目标产物产量与得率。同时，证明了汉逊酵母作为细胞工厂进行生物合成的应用潜力，构建的平台菌株也为后续实现工业化应用奠定了良好基础。