巴斯德毕赤酵母中甘油通过GT1和MXR1调控甲醇代谢的分子机理研究

AOX1 (alcohol oxidase 1) start the methanol catabolism when methanol is as sole carbon source in Pichia pastoris. Pichia pastoris was developed as one of the most important eukaryotic expression systems based on the strong AOX1 promoter. Glycerol can repress AOX1’s transcription, but the molecular mechanism is unclear. In our past work, GT1 (glycerol transporter 1) was firstly cloned and identified. And the ΔGT1 mutants relieve the repress of glycerol to AOX1. After analysis, we believe the interactions of GT1 gene, MXR1 protein, and AOX1 gene play an important role in the regulation of methanol metabolism. In this project, we will: construct the 3D structure of GT1, and research it’s action mechanism; Research the metabolic characteristics of glycerol and methanol, research the expression of GT1, MXR1, and AOX1 through the low/high expression of GT1 and MXR1; Research the interaction of GT1 gene and MXR1 protein through EMSA; Research exogenous protein’s expression when ΔGT1 mutants as host; Determination the new transcription factors through transcriptome sequencing. The project will clarify the the interactions of GT1, MXR1, and AOX1, exploring the molecular mechanism of glycerol’s repression to methanol metabolism.

巴斯德毕赤酵母在甲醇为唯一碳源时，醇氧化酶AOX1启动甲醇分解代谢，基于高效的AOX1启动子，该菌被开发为最重要的真核表达系统之一，但甘油可以阻遏AOX1的转录，其分子机理尚不清楚。经前期研究，申请者首次克隆并鉴定了甘油转运体GT1，发现ΔGT1突变株可以解除甘油对AOX1的阻遏。经分析，GT1基因、MXR1蛋白、AOX1基因的相互作用在甘油调控甲醇代谢过程中扮演重要角色，本项目拟：研究GT1的三级结构和作用机制；通过GT1、MXR1的低/高表达研究菌株对甘油、甲醇的代谢特征，及GT1、MXR1、AOX1表达特性；通过EMSA实验研究GT1基因和MXR1蛋白的相互作用；研究ΔGT1突变株为宿主、甘油为碳源时外源蛋白表达的新模式；通过转录组测定研究甘油阻遏甲醇代谢信号通路中的信号分子。项目将阐明MXR1在GT1抑制AOX1信号通路中的重要作用，探索巴斯德毕赤酵母甘油阻遏甲醇代谢的分子机理。

巴斯德毕赤酵母在甲醇为唯一碳源时，醇氧化酶AOX1启动甲醇分解代谢，基于高效的AOX1启动子，该菌被开发为最重要的真核表达系统之一，但甘油可以阻遏AOX1的转录，其分子机理尚不清楚。基于前期发现的甘油转运体GT1开展巴斯德毕赤酵母中甘油通过GT1和MXR1调控甲醇代谢的分子机理研究。表达纯化了GT1，体外实验验证了GT1与甘油的互作。分析了甘油转运体GT1的甘油转运机制及其对甲醇代谢的影响。确定了GT1定位于细胞质膜。预测了PGT1结构，发现了其中与MXR1相互作用的位点是–141至–138位的CCCC。研究了毕赤酵母低表达和高表达GT1、MXR1时在不同培养基中的生长特征、基因表达特性，发现GT1通过提高细胞内的甘油含量抑制MXR1的表达，进而抑制甲醇代谢，MXR1和GT1互相抑制，在不同碳源情况下调控甲醇代谢。研究了△GT1菌株在不同培养基中生长特性，结果显示突变株对甘油的转运效率明显降低，AOX1酶活测定显示，突变株在甘油甲醇混合培养基中表现出了良好的抗阻遏效果，并对样品进行转录组测定。筛选得到21个高表达基因，GT1对甘油代谢影响的13个基因和对甲醇影响的23个基因。进而对以上基因进行了初步分析，构建了AMPK/SNF1信号通路和MAPK/HOG信号通路对甲醇代谢调控的可能模式图。对以ΔGT1为宿主表达EGFP外源蛋白的发酵培养条件进行了优化，结果显示，96小时培养后甘油甲醇混合碳源流加模式菌体量显著提高，总体EGFP表达量显著提高。运用CRISPR/Cas9基因编辑系统在毕赤酵母基因组上成功将MXR1第215位丝氨酸定点突变，发现了MXR1新的调控模式。研究结果进一步丰富了巴斯德毕赤酵母甲醇代谢调控的分子机理，并尝试开发了新的外源蛋白表达模式，体现出了良好的理论价值和应用价值。