临床黄芪-莪术配伍抗肺癌血管生成在TGF-β1/MAPK/HIF-1α通路的作用机制研究

Angiogenesis plays an important role in malignant tumor cell proliferation, metastasis, it is the result of the cascade reaction of angiogenesis start by HIF-1α.Through the MAPK signaling pathway, TGF-β1 regulate the HIF-1α expression, and intervene the process of tumor angiogenesis,intervention of the key targets in TGF-β1/MAPK/HIF-1α signaling pathway is a new research hotspot to inhibit tumor angiogenesis. The compatibility of Astragalus-zedoariae is an experienced prescription and our previous study found that the YiQiFuZheng and HuoXueHuaYu in the Fuzheng Sanjie prescription can interfere the HIF-1α expression and effect the tumor angiogenesis, the combined application can enhance the effects, the main reason for improving curative effective is the combination of Astragalus-zedoary. In our project, the alone and combined application of Astragalus, Zedoariae and Radix Astragali Total Saponin, Astragalus Polysaccharide, curcumin, β-elemene be used to do the in vivo and in vitro experiments. By immunohistochemistry, Western Blotting and real-time PCR technique to observe the key factors expression in TGF-β1/MAPK/HIF-1α signaling pathway, to expound the Astragalus-zedoariae molecular mechanism of Anti-angiogenic on lung carcinoma, to provide the basis for clinical application.

血管生成是肿瘤生长、转移等的关键环节，它是HIF-1α启动的血管生成信号级联反应的结果；TGF-β1通过MAPK信号通路调控HIF-1α，影响血管生成。故干预TGF-β1/MAPK/HIF-1α调控体系的关键靶点已成为临床抗肿瘤研究新热点。黄芪-莪术是临床常用配伍。前期研究发现，经验方扶正散结方中益气扶正和活血化瘀两组中药抗肿瘤血管生成作用较突出，且与HIF-1α通路有关，联合应用时效果会得到增强，分析黄芪-莪术配伍是合用后效果加强的主要原因。为证实并阐明其机制及可能的物质基础，本项目拟利用动物及细胞实验，分别取黄芪、莪术及其已知相关活性成份黄芪总皂苷、黄芪多糖和姜黄素、β-榄香烯，从TGF-β1/MAPK/HIF-1α通路入手，运用免疫组化、蛋白印迹、RT-PCR等生物学技术，观察单独及联合应用时对该通路的影响，以阐明其配伍应用时抗肺癌血管生成作用机制及可能的物质基础，为临床提供依据。

主要研究内容：1.黄芪、莪术不同配比对小鼠Lewis肺癌肿瘤生长及血管的影响；2.黄芪、莪术不同配比对小鼠Lewis肺癌TGF-β1/MAPK/HIF-1α信号通路关键因子TGF-β1、ERK1/2、JNK、p38MAPK、HIF-1α、VEGF表达的影响；3.黄芪总皂苷、黄芪多糖与β-榄香烯、姜黄素的组合筛选及其对人肺腺癌 A549细胞株增殖及TGF-β1/MAPK/HIF-1α信号通路关键因子TGF-β1、ERK1/2、JNK、p38MAPK、HIF-1α、VEGF表达的影响；4.对黄芪、莪术及其主要抗癌成份在抑制血小板凝聚、上皮间质转化、肿瘤血管结构与功能、肿瘤免疫微环境的影响进行了研究。取得结果：1.不同比例黄芪-莪术配伍能够抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠移植瘤的生长和转移；2.不同比例黄芪-莪术配伍能够降低瘤组织MVD，下调TGF-β1/MAPKs/HIF-1α信号通路关键因子TGF-β1、HIF-1α、VEGF等的表达，抑制肿瘤血管生成；3.黄芪多糖联合姜黄素是4种已知有效成分的最佳组合，能抑制肺癌A549细胞增殖，通过调控Bax、Bcl-2与caspase-3的表达促进其凋亡；下调TGF-β1/MAPKs/HIF-1α信号通路关键因子TGF-β1、HIF-1α、VEGF等的表达，抑制肿瘤血管生成；4.黄芪莪术可降低TCIPA环节中血浆TF含量、降低血小板活化程度,减少血小板聚集,降低肿瘤细胞的转移；还与提高E钙粘蛋白表达、降低MMP-9表达相关，其作用优于单用黄芪、莪术；5.黄芪莪术配伍可增加周细胞覆盖率，有效组分姜黄素能抑制肿瘤血管内皮细胞增殖,黄芪多糖和姜黄素均能抑制肿瘤血管内皮细胞的迁移且两者合用可协同增效；6.转录组学实验显示，黄芪莪术可上调与T细胞增殖、分化及功能相关基因如CD2、CD4、CD3e等；增加CCL5、CD2、CD4、CD8a、CXCR3、IFN-γ、IL-2和IL-12 的mRNA的转录，提示其可双重调控血管和免疫。科学意义:该研究说明黄芪莪术配伍可从多方面抑制肺癌生长转移，而其抑制肿瘤血管生成、促进血管正常化体现了破瘀散结抗癌功效，其抑制血小板凝聚体现了活血化瘀抗癌的价值。黄芪莪术配伍应用作用更好，体现了“气帅血行”的科学性，其抑制间质转化、改善免疫、促进血管正常化的作用，显示了扶正抗癌的科学内涵，启发了新的方向。