FOXO1在TNFR-Fc抑制急性肺损伤肺泡上皮细胞凋亡中的机制研究

Our previous study showed that TNFR-Fc attenuated lung injury and cell apoptosis in ALI mice induced by LPS via TNF-α blockade, accomany with downregulating the expression of MAPK and the ratios of Bax/Bcl-2 gene. FOXO1 is important in the process of apoptosis and proliferation. We hypotheses that FOXO1 was the key transcription factor in the signal transduction pathway following TNF-α blockade. However the mechanism of FOXO1 enrolling in attenuating the apoptosis of alveolar epithelial cell is unclear. To achieve the potential therapeutic value of TNFR-Fc in ALI, we are going to explore the effect of FOXO1 in ALI mice treated with TNFR-Fc. The composite methods, including kinase assays, gene chips, bioinformatics methods and RNA interference, are to be key steps in our study. We will check several valuable profiles such as FOXO1 activation, gene transcription regulated by FOXO1, interaction between FOXO1 and NF-κB after TNFR-Fc administration in ALI mice. Promisingly, we can elucidate the anti-apoptosis mechanism of TNFR-Fc in attenuating lung injury of ALI mice via FOXO1.

我们的前期研究发现在LPS诱导ALI小鼠模型中以TNFR-Fc中和过度表达的TNF-α能显著减轻肺组织细胞凋亡，同时伴随MAPK活性下调 ，Bcl2/Bax基因表达比值上调。既往的研究表明FOXO1参与了组织细胞的凋亡/增殖调控过程。我们推测，FOXO1可能是TNFR-Fc中和过量的TNF-α、减轻肺组织细胞凋亡调控的关键节点。鉴此，本课题通过激酶分析、基因芯片、生物信息学、RNA干扰等方法，研究TNFR-Fc干预后，FOXO1活化、FOXO1对凋亡相关基因的转录调控及对细胞凋亡的影响，探讨TNFR-Fc中和TNF-α，打破ALI炎症/氧化放大环路过程中，FOXO1在调控细胞凋亡/增殖中的作用机制，从细胞凋亡/增殖的角度诠释TNF-α中和减轻肺组织结构损伤ALI治疗策略，为TNFR-Fc治疗 ALI 提供更充分的临床前期实验依据，为保护肺结构细胞的干预靶点药物研发奠定理论及实验基础。

我们前期发现在LPS诱导ALI小鼠模型中以TNFR-Fc中和过表达的TNF-α能显著减轻肺组织细胞凋亡。我们推测，FOXO1可能是TNF-α诱导肺组织细胞凋亡调控的关键节点。鉴此，我们建立ALI动物及炎症细胞模型，探讨FOXO1在TNFR-Fc减轻炎症状态下肺组织细胞凋亡的可能机制，阐明 FOXO1在不同炎症状态下对细胞凋亡及凋亡相关通路的影响。. 我们首先比较了LPS与TNF-α对A549细胞炎症反应活化的影响，发现TNF-α可以有效活化A549细胞内NF-κB信号通路并放大炎症反应，能在细胞水平引起类似革兰阴性菌所致炎症反应，确立使用TNF-α作为后续细胞炎症模型的刺激手段。其次，通过气管内滴入LPS复制ALI小鼠模型，发现在刺激后FOXO1表达下调后逐渐回升，与FOXO1在TNF-α诱导炎症细胞模型中的表达变化规律一致。第三，探讨了TNFR-Fc减轻LPS致ALI模型炎症及氧化损伤中FOXO1表达的变化规律，结果表明TNFR-Fc中和TNF-α后，胞浆、胞核FOXO1均去磷酸化活化，胞核内总FOXO1表达增加。TNFR-Fc能明显抑制LPS诱导ALI小鼠肺组织结构细胞凋亡，与TNFR-Fc逆转TNF-α引起的FOXO1表达下调，NF-κB活性降低，Bcl-2/Bax比值升高相关。第四，研究了FOXO1在不同炎症状态下对细胞凋亡的影响：持续转染及炎症刺激，高表达FOXO1能抑制炎症反应通路NF-κB活性，上调Bcl-2/Bax比值，抑制肺组织细胞凋亡；而修复转染损伤后再刺激的细胞，高表达FOXO1则通过加强的炎症反应通路，下调Bcl-2/Bax比值，促进肺组织细胞凋亡，提示不同炎症状态下FOXO1对细胞凋亡表现出不同调节活性。第五，探讨了持续炎症损伤状态下FOXO1对细胞保护的机制。FOXO1影响炎症诱导细胞凋亡过程中的氧化应激，可通过促进SOD与CAT表达，加强清除细胞内氧自由基，从而减少细胞凋亡。第六，通过基因芯片筛查与FOXO1下游调控相关的基因，筛选出与细胞增殖、分化、凋亡相关的表达差异基因共554个，其中上调317个，下调237个。. 本研究确认了FOXO1参与TNF-α诱导的细胞氧化应激、炎症失衡过程，且在细胞的不同病理生理状态下，对细胞凋亡存在双向影响，可能与FOXO1不同活化状态及调节靶基因表达不同相关。