乳铁蛋白对成骨细胞MAPK信号通路调控作用的研究

目前全世界约有2亿人患骨质疏松症，其发病率己跃居常见病、多发病的第7位，严重地危害着人类的健康与生活质量。近几年最新的研究和本项目组的前期研究均表明乳铁蛋白具有非常良好的体内、体外成骨活性，是一种全新的具有治疗骨质疏松症潜力的天然活性物质。然而，目前对乳铁蛋白成骨活性的研究主要停留在生理功能评价层面上，其确切的作用机制尚不明确。.本项目从信号转导与转录调控的角度出发，瞄准成骨细胞代谢调控的中心环节-MAPK信号通路，通过体外细胞培养，并应用抑制剂阻断、RT-PCR和Western blot技术，分析MAPK信号通路的三条经典信号途径-ERK、JNK、p38旁路在乳铁蛋白促进成骨细胞增殖与分化功能中的作用，并阐明其中关键的信号传导步骤，为从细胞水平和分子水平揭示乳铁蛋白成骨活性的作用机理提供科学证据，并为开发新型的具有改善骨质疏松症作用的功能乳制品提供理论依据。

乳铁蛋白是一种具有多重生理功能的天然活性蛋白，大量研究已经证明其具有强大的体内体外成骨活性。然而，乳铁蛋白成骨活性的机理现在仍不明确。本研究旨在阐明乳铁蛋白对成骨细胞的作用机制，特别是乳铁蛋白促进成骨细胞分化的细胞信号传导途径。本课题以原代成骨细胞和前成骨细胞系MC3T3-E1为模型，证明了乳铁蛋白可以有效地促进成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶（ALP）的活性和骨钙素（OCN）的表达，以及矿化结节的形成。此外，乳铁蛋白还可以显著增加骨特异性转录因子Runx2的磷酸化水平，表明乳铁蛋白可以促进成骨细胞的分化成熟。乳铁蛋白刺激MC3T3-E1细胞后，细胞内p38 MAPK磷酸化水平和激酶活性显著升高，利用通路抑制剂和siRNA 敲除手段抑制p38 MAPK通路后，乳铁蛋白促成骨细胞分化的作用显著降低。同时，乳铁蛋白诱导的Runx2磷酸化也被抑制。乳铁蛋白激活p38 MAPK通路的同时，我们发现PKA通路也被激活。PKA抑制剂实验证明PKA通路也是乳铁蛋白促进成骨细胞分化的主要途径，并且是位于p38 MAPK上游的关键靶点。为了进一步阐明乳铁蛋白的信号转导途径，我们研究了乳铁蛋白受体LRP1的作用。通过构建慢病毒介导的稳定敲除MC3T3-E1细胞，我们证明乳铁蛋白受体LRP1并不参与乳铁蛋白对成骨细胞分化的促进过程，可能存在其他未知受体介导了乳铁蛋白的这一作用。本研究首次阐明了乳铁蛋白促进成骨细胞分化的信号转导机制，即乳铁蛋白通过PKA-P38 MAPK信号转导途径促进转录因子Runx的磷酸化，从而引发分化标志物ALP与OCN的表达，加速了分化进程。在这一过程中，可能存在除LRP1以外的其它受体参与其中。