miR-21调控PTEN基因对脓毒症小鼠肺保护作用的实验研究

抑制肺内巨噬细胞过度激活、降低肺内炎症过度反应是脓毒症时肺保护的根本措施。国外最新研究和申请人参与的国家自然科学基金的研究表明miR-21与肺泡巨噬细胞炎症反应密切相关，本申请项目拟探索性地将miR-21转染进体外培养的原代小鼠肺泡巨噬细胞，观察其对靶基因PTEN和PI3K/PKB信号通路及其下游炎症因子的影响，研究miR-21调控肺泡巨噬细胞炎症反应的机制。在此基础上，考虑到肺通过呼吸道与外界相通的解剖学特点和聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)的肺靶向性特点，创新性地将专门用于体内实验的改进型in vivo-jetPEI介导的miR-21由气道内滴入小鼠脓毒症肺损伤模型，观察miR-21在肺内转染效率和调控细胞因子的表达情况，评价其抑制脓毒症肺内炎症反应的效果，探讨其对脓毒症小鼠肺损伤保护作用机制，为脓毒症肺损伤的治疗探索一种新方法。

急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症目前主要治疗手段是机械通气，但其死亡率仍高居 40%左右。肺泡巨噬细胞过度激活导致肺内过度的炎症反应是脓毒症肺损伤发生的关键因素，近年研究和我们的前期工作表明 miR-21与肺泡巨噬细胞炎症反应密切相关。本课题选用肺泡巨噬细胞作为研究对象，用 LPS 刺激巨噬细胞体外模拟急性肺损伤。体外转染miR-21 mimic和miR-21 inhibitor 分别上调和下调巨噬细胞内miR-21的表达，通过观察miR-21对PTEN/PI3K/PKB信号通路及下游炎症因子表达的影响，分析miR-21对LPS诱导肺泡巨噬细胞炎症反应调控的可能机制。同时体外转染PTEN siRNA下调巨噬细胞内PTEN的表达，通过观察PTEN下调后对PI3K/PKB/NF-κ信号通路及下游炎症因子表达影响，进一步明确miR-21通过PTEN对急性肺损伤的调控。最后于体外构建脓毒症肺损伤模型，观察miR-21的表达情况，探讨miR-21对脓毒症肺损伤大鼠的保护作用。我们按原计划开展了实验研究，并取得了预期的研究成果。（1）在LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中TNF-α表达上调，同时也诱导miR-21表达上调，提示miR-21可能参与了LPS诱导的炎症反应的调控。（2）体外转染miR-21 mimic能明显上调细胞内miR-21的表达，并有效下调靶蛋白PTEN的表达。上调miR-21后可增加LPS刺激的NR8383细胞炎症模型中p-AKT表达，促进NF-κB 核移位和炎症因子的释放；（3）体外转染miR-21 inhibitor能明显抑制细胞内miR-21的表达，并有效上调靶蛋白PTEN的表达。下调miR-21后可抑制LPS的刺激的NR8383细胞炎症模型中p-AKT表达，减少NF-κB 的核移位及炎症因子的释放；（4）体外转染PTEN siRNA能明显抑制细胞内靶蛋白PTEN的表达，下调PTEN 后可增加LPS刺激的NR8383细胞炎症模型中p-AKT表达，促进NF-κB 的核移位及炎症因子的释放；（5）体内LPS气管内滴入构建的脓毒症肺损伤可诱导miR-21表达升高。结合体外实验研究结果，表明在大鼠脓毒症肺损伤模型中， miR-21通过作用于靶蛋白PTEN来调控PI3K/PKB的表达，影响NF-κB的活化，从而调控炎症因子的释放。