褪黑激素促进绒山羊绒毛生长中Wnt10b基因表达及其作用机制的研究

Wnt10b is one of the most important members of Wnt family, of which expression is obviously restricted and important to hair plate formation and maintenance. Our prevoius reseach has discovered that implanting melatonin (MT) to Inner Mongolia Cashmere goats advanced the growth of cashmere by two months and improved the quantity of cashmere. The result of qRT-PCR showed, during telogen and catagen phase, the expression of Wnt10b was increased in the Cashmere goats hair follicles after MT implanting, which means that Wnt10b was involved in the process of Cashmere goat hair growth promoted by MT. However, its signal pathway and the regulation mechanism are not clear, and there are few reports on them. Therefore, in this study, the effect and mechanism of MT in promoting the growth cycle of cashmere are to be detected in vivo and vitro, using In Situ Hybridization, qRT-PCR, IHC, Western Blot, Adenovirus mediated purpose gene and RNAi techneques. Furthermore, the signal pathway of Wnt10b inducing hair follicle growth is to be explored by blocking the key molecules in classic Wnt signal pathway with interference technology. The results of this project is significant for revealing the time for artificial regulation of cashmere growth and increasing the production of cashmere of Inner Mongolia Cashmere goats.

Wnt10b是 Wnt 家族的重要成员之一，具有最明显的限制性表达，对毛发基板的形成和维持非常重要。本课题组在研究中发现：给内蒙古绒山羊在体埋植褪黑素可提早 2 个月诱发新绒生长，提高羊绒产量，经qRT-PCR检测埋植褪黑素上调了皮肤毛囊休止期和退行期Wnt10b基因的表达，可推测Wnt10b参与了褪黑素促进绒毛生长的过程，但其信号通路及调控机制尚不清楚，也鲜有报道。因此，本课题拟采用转录组测序、原位杂交、qRT-PCR、免疫组织化学、Western blot、腺病毒介导Wnt10b基因过表达、RNAi等技术，从体内、体外两方面研究Wnt10b基因在褪黑素促进绒毛生长周期中的表达和作用机制，并利用干扰技术阻断经典 Wnt 信号通路关键因子，寻找Wnt10b 诱导毛囊生长的信号通路，对实现人工调控绒毛生长时间和提高内蒙古绒山羊绒毛产量具有重要指导意义。

褪黑激素能够促进毛皮动物的绒毛生长、提高毛皮的产量和质量。前人通过春季给绒山羊皮肤埋植褪黑激素，可实现一年内山羊绒生长两次，而且埋植组的绒产量高于对照组，经qRT-PCR检测埋植褪黑素上调了皮肤毛囊休止期和退行期Wnt10b基因的表达，可推测Wnt10b参与了褪黑素促进绒毛生长的过程，但其信号通路及调控机制尚不清楚。因此，本课题拟采用转录组测序、qRT-PCR、免疫组织化学、Western blot、调控Wnt10b基因表达等技术，从而研究Wnt10b基因在褪黑素促进绒毛生长周期中的表达和作用机制。.主要研究内容和重要结果如下：.1.应用生物信息学技术对内蒙古成年绒山羊试验组与对照组2月、10月、12月皮肤组织转录组数据进行差异基因的筛选。3个月份共筛选出1478个差异基因，其中上调的1014个，下调的464个。.2.荧光定量PCR结果显示：埋植褪黑激素，改变了Wnt10b、β-catenin、FGF21、SFRP1和TCHHL1基因在皮肤毛囊生长期和休止期的表达。.3.Western blot结果显示：Wnt10b蛋白的表达量在12月、2月试验组显著高于对照组(P<0.05)。β-catenin蛋白表达量在9月试验组显著低于对照组(P<0.05)。.4.免疫组化结果显示：对照组Wnt10b基因在兴盛期主要强表达于毛囊中上部的内、外根鞘，而实验组Wnt10b基因除了在内、外根鞘表达以外，在毛母质也有少量表达；休止期，对照组Wnt10b基因主要表达在外根鞘，而实验组Wnt10b基因除外根鞘外，毛母质也有少量表达；对照组β-catenin基因在兴盛期主要强表达于毛囊的外根鞘，而实验组除了强表达于毛囊外根鞘，还少量表达于毛母质。在休止期对照组β-catenin基因主要表达于外根鞘，在内根鞘与毛母质无表达，实验组在外根鞘与毛母质均有表达。 .5.HE染色结果显示：实验组与对照组在2-3月份进入休止期，休止期过后初级毛囊开始变大，次级毛囊数量明显增多，毛囊开始进入重建阶段。在生长前期的5、6月份，实验组的次级毛囊数量显著高于对照组（P<0.05）。.研究结果，阐明褪黑激素、Wnt10b表达与毛囊生长之间的关系，从而探讨Wnt10b在褪黑激素促进绒毛生长中的作用机理，对提高绒山羊绒毛产量具有重要指导意义。