CUL-9突变通过泛素化抑制Akt功能致结直肠癌肝转移西妥昔单抗耐药

Liver metastasis is significantly associated with prognosis of colorectal cancer. Colorectal liver metastasis (CLM) with wild-type RAS significantly benefits from cetuximab-based treatment. Whereas, there are still half of patients showed primary resistance to cetuximab, and the underlying mechanism is largely unknown.Using next-generation sequencing, bioinformatics analysis, and efficacy analysis, we identified 6 new potential predictive biomarkers for cetuximab including CUL-9 c.5918A>T mutation. We verified the predictive value of CUL-9 mutation with a predictive model for cetuximab. Then following experiments in cell line indicated that CUL-9 mutation significantly reduced the level of phosphorylation and ubiquitination of Akt. Referring to the knowledge that CUL-9 is a member of E3 ubiquitin ligases and that ubiquitination is necessary for Akt regulation, and coimmunoprecipitation assay revealed that CUL-9 interacted with Akt, we came up to the hypothesis that CUL-9 mutation is correlated with cetuximab resistance by regulating ubiquitination of Akt. Based on all results above, we would focus on the exact mechanisms of regulation of ubiquitination of Akt by CUL-9. This project is tightly associated with clinical practice. The achievement will help further tailoring of suitable population for cetuximab, and provide molecular target for drug design.

肝转移显著影响结直肠癌预后。西妥昔单抗治疗RAS野生型结直肠癌肝转移疗效显著，但尚有四成患者存在原发耐药，且机制不明。申请人前期通过二代测序，生信分析，疗效分析等系列步骤，筛选出CUL-9基因c.5918A>T突变（简称CUL-9突变）等6个新型标志物，进而构建西妥昔单抗疗效预测模型，确认了CUL-9突变的耐药表型。细胞实验显示，CUL-9突变导致EGFR通路下游Akt磷酸化和泛素化水平降低。文献提示CUL-9是泛素连接酶，而泛素化是Akt的必要调控方式，前期的免疫共沉淀更提示了CUL-9和Akt间的直接作用关系。申请人据此提出科学假设，CUL-9突变通过调控Akt泛素化参与西妥昔单抗耐药。本项目拟重点探讨CUL-9调控Akt泛素化的具体机制，描绘CUL-9调控Akt的分子生物学过程。本项目紧密结合临床，有助于筛选西妥昔单抗的敏感人群，并为新型靶向药提供线索。

本项目通过前期的高通量二代测序聚焦于结直肠癌中尚无报道的CUL9基因。截至目前，对于CUL9功能的认识尚不完善，其中能够明确的两个特点为：第一，CUL9拥有泛素连接酶E3的功能，第二，CUL9参与p53的功能调节。因此，本项目从临床表型到细胞功能再到分子机制，依次探究了CUL9在结直肠癌中的作用和潜在价值。首先，在临床表型方面，我们通过组织芯片的免疫组化染色发现，CUL9高表达是结直肠癌预后不良的危险因素（HR=1.897，95%CI1.538-2.339，p<0.001）。同时，来自GEO数据库（p=0.038）和TCGA数据库（p<0.001）的数据集也分别验证了这一表型。随后的细胞试验中，我们成功构建了CUL9敲减和过表达的细胞系。细胞试验结果显示，在p53野生的肠癌细胞系中（HCT116和RKO），敲除CUL9后肿瘤细胞增殖受到了明显抑制；而在p53突变的肠癌细胞系（HT29，Caco2和SW1463）中，敲除CUL9后，肿瘤细胞的增殖获得了促进。进一步的体内实验也显示CUL9在肠癌中的生物学功能存在完全相反的情况。随后，通过TCGA数据库分析，发现CUL9的mRNA表达量与铁死亡相关分子的mRNA表达量呈现明显的相关性。在分子机制方面，我们先在p53野生的肠癌细胞系中确定了CUL9选择性地参与了erastin诱导的铁死亡过程。随后的IP-Western分析确定HNRNPC是CUL9的泛素化底物，敲除CUL9导致HNRNPC蛋白水平升高，从而降低p53野生的肠癌细胞系对Erastin的敏感性。总的来说，CUL9在p53野生的肠癌细胞系中持续发挥癌基因的倾向。在这方面，靶向CUL9可能是一种新的肠癌治疗策略。此外，CUL9参与铁死亡过程是否能导致肠癌的耐药表型在本研究中尚未设计，有待进一步研究。