金属蛋白内配位化学键的单分子研究

The rupture and formation of chemical bonds are at the heart of Chemistry research. Thus, the strength of chemical bond directly determines how difficult the bond can rupture and form. Consequently, the knowledge of chemical bond strength provides us strong evidence to understand the stability and chemical reactivity of substances. Because of the variety of chemical bonds, it is key to discover the bonding rule and trend for understanding all these chemical bond strength and properties. Traditionally, the bond rupture need external energy like heat. However, heat is not suitable for studying most bio-macromolecule. As many proteins are highly sensitive to high temperature and become denatured. In addition, So many different types of bonds are inside the biomolecule. It is challenging to specifically measure one type of chemical bond, such as the metal-ligand inside metalloprotein. To solve this problem, we propose to use AFM based single molecule force microscopy as a novel tool. By taking the advantage of mechanical force, we use AFM to unfold the metalloprotein and measure the metal-ligand bond strength inside them. We choose a protein which binds to tens of different metal ions as a model system to study their metal-thiolate bond strength. We hope to systematically measure these different metal-thiolate bond and discover their similarity and difference. As an ultimate goal, we hope to find a general bonding principle for these important metal ligand bonds.

化学键的断裂和形成是化学研究的核心领域之一。键的强弱直接决定了键断裂和形成的难易程度。所以化学键强度的研究为我们在分子层次上理解物质的稳定性和活性提供了重要根据。化学键的种类繁多，因此获得成键规律是理解和预测化学键的关键。化学键的断裂需要外界提供能量，最简单的方法就是通过加热升温为体系提供热能。然而这种研究方式对于生物大分子，特别是蛋白质体系中的金属配位键有较大局限性。大部分蛋白质对温度非常敏感，在加热条件下会变性失活。其次生物大分子内的化学键种类多，如何精准的测量大分子内部众多化学键中的某一种键的强度具有极大挑战。我们提出采用以原子力显微镜为基础的单分子力谱，利用力学操纵的方法，来进行蛋白质的力学解折叠实验和从而测量其中金属配位键的强度。我们采用能与多种金属相结合的金属硫蛋白作为研究对象，希望系统的研究不同金属巯基键的强度，寻找它们之间的异同，探索此类重要化学键的特性和规律。

蛋白内金属配位键的强度的定量测量及其与蛋白结构间的相互作用的研究，对理解生物体系内金属键的规律有着重要意义。然而传统宏观测量技术可能造成的个体事件结果的平均化，限制了人们对复杂蛋白体系中的金属配位键进行测量研究。以原子力显微镜为基础的单分子力谱技术，能够在单个分子层次高分辨地对单个蛋白质分子展开机械力学研究，是测量蛋白质中金属配位键的有效工具。本项目以“金属蛋白内配位化学键的单分子研究”为主题，以一种结构简单但配位能力强的金属蛋白(Metallothionein, MT)为主要研究对象。运用单分子力谱技术，测量了同种蛋白质分子中不同金属配位键强度，探索了其中配位化学键的强弱变化规律，以及配位键强度和蛋白质结构力学稳定性间的相互作用和影响等两个关键科学问题。项目负责人以通讯或共同通讯作者发表论文7篇。主要研究成果包括：1.单分子力谱研究比较脱金属MT蛋白和含镉配位的MT蛋白的机械稳定性差异。验证了脱金属MT蛋白自身蛋白结构机械稳定性极弱，而镉-硫金属簇的形成增强了蛋白结构整体的机械强度，并且观测到含镉MT蛋白中金属硫簇的拉伸断裂具有多步多种的断裂途径。2.对含锌配位的MT蛋白进行了单分子力谱测量，研究显示含锌MT蛋白同样具有多种解折叠路径和解折叠中间体，结合对蛋白拓扑结构的分析得出，MT中的金属硫簇是富于动态变化的，至少有五个不同的金属硫键能够发生轻微游离。计算机模拟结果佐证，MT中金属硫簇并且能够独立于蛋白骨架重构之外发生重排，甚至在蛋白结构处于折叠状态时金属配位键仍能够进行形成或断裂。3.对含锌和含镉MT蛋白的解折叠动力学研究，显示含镉MT蛋白比含锌MT蛋白更稳定。通过与单核金属硫蛋白Rd比较，MT的多核金属硫簇的稳定性更低，进一步体现了金属配位键影响蛋白质结构稳定性的同时，其自身键强度也为蛋白质内部环境所影响。