基因重组介导蛋白DprA的结构与功能关系研究

基因重组介导蛋白DprA是细菌天然转化机制中的一个关键蛋白。这个蛋白在有天然转化活性的细菌中普遍存在并高度保守。实验表明，DprA与RecA蛋白结合并催化ssDNA与基因组DNA的同源重组。敲除DprA后细菌基本丧失天然转化活性。这个蛋白在幽门螺旋杆菌中尤为重要，因为幽门螺旋杆菌具有很强的天然转化活性,这个活性对它的致病性起重要作用。通过整合外源DNA到基因组中，幽门螺旋杆菌可以获得毒性因子（如cag独立岛）、改变抗原特性以及获得基因多样性以适应在人类消化系统中生存。本项研究将解析Hp DprA及其与ssDNA或RecA复合物的晶体结构，阐释其功能活性的重要结构基础。通过结构指导下的系列突变和结构-活性关系分析，确定DprA与RecA和ssDNA的结合位点和作用方式，揭示天然转化的分子机理。本项研究将促进我们对天然转化过程的了解，也将为我们控制幽门螺旋杆菌的感染提供新的思路。

我们成功地解析了HpDprA及其与单链DNA（ssDNA）复合物的高分辨率晶体结构，并以晶体结构为基础，设计制备了一系列HpDprA的功能性突变体，使用多种生物物理和生物化学技术（如SPR，EMSA，MST等）鉴定了HpDprA及其突变体与不同长度和序列的ssDNA及dsDNA之间的作用，提出并验证了HpDprA以高亲和力、低序列特异性结合ssDNA的结构机理：HpDprA二聚体通过表面两个由保守残基组成的直径约为6埃的正电结合口袋与ssDNA作用，而一个极为保守的精氨酸残基的侧链起着调节ssDNA进入结合口袋的开关作用。生化实验表明二体是DprA行使功能的基本单位；少于15nt的ssDNA基本不结合；越长的ssDNA结合力也越高，但是超过40nt以后ssDNA结合力不会增加。因此，我们最终提出了一个DprA保守结构域结合ssDNA的低聚物模型：DprA结构域依靠Arg52打开正电区结合口袋以容纳一个ssDNA的碱基，然后，一个DprA功能单位二体“捕获”ssDNA远端的两个碱基从而高效地结合底物；ssDNA链的长度必须超过15nt才能同时结合二体中两个单体的结合口袋以形成稳定的复合物，而两个结合口袋间的ssDNA具有一定的柔性有利于参与与RecA的相互作用。..这些实验结果表明我们已经完成了项目的原定目标。有关成果已经发表于SCI杂志Nucleic Acid Research。