处于氧化态的HIV-1衣壳蛋白碳端结构域的结构与生物学意义研究

HIV-1 is the causative agent of AIDS and has been subject to intensive research in past three decades. Assembled from thousands of capsid proteins (CA) and encasing the viral genome, the viral capsid is spherical in the immature virion, whereas adopts conical morphology as the virion matures and gains infectivity. The CA comprises two fold domains, namely N-terminal domain and C-terminal domain (CTD). As shown by cyroEM, the CA adopts different structures in the immature and mature virions. However, owing to protein dynamics, the CA proteins has been recalcitrant to structure characterization at atomic-resolution. We found that the CA-CTD can be irreversibly oxidized, with the oxidized protein displaying a different NMR spectrum. Based on electrochemical studies, we propose that the CA-CTD protein is oxidized and adopts a different structure when the CA protein enters bloodstream. To visualize the structure difference between reduced and oxidized CTD proteins, we plan to use a combination of biophysical techniques, including NMR, analytical ultracentrifugation and small-angle X-ray scattering (SAXS). In addition, we will introduce point mutations or add reducing agent in the medium, to elucidate the functional role of CTD oxidation. Taken together, the research we propose will allow us to understand the maturation mechanism of HIV-1, opens up new direction for drug discovery and pharmaceutical invention.

人类免疫缺陷病毒（HIV-1）成熟机制是近年的研究热点和难点。包裹遗传物质的病毒衣壳初期呈球形，病毒成熟后呈纺锤形。衣壳由衣壳蛋白（CA）组装而成，CA包括氮端结构域（NTD）和碳端结构域（CTD）。电镜证实，未成熟和成熟病毒中CA的结构不同，但原子分辨的结构变化及变化诱因对病毒成熟的影响尚不明确。最近我们发现，CTD能被不可逆氧化，被氧化后其核磁共振谱图发生明显变化。鉴于细胞内呈还原电势、细胞外呈氧化电势这一事实，我们推测HIV-1被释放到细胞外后，CTD可被氧化，导致CA结构变化，促使衣壳变形，最终使HIV-1成熟。为验证此假设，本项目拟采用多种核磁共振方法，结合小角X光散射，表征氧化态CTD结构，并比较氧化态和还原态CTD结构的差异；通过定点突变或者加入还原剂，揭示氧化态CTD在HIV-1成熟中的作用。结果将有助于进一步揭示HIV-1成熟机制，并为抗HIV-1药物的研发提供新方法。

人类免疫缺陷病毒(HIV-1)中包裹遗传物质的衣壳（CA）发生形变是病毒成熟的标志性特征，而目前导致衣壳发生形变的机制，即病毒成熟的机制还未得到全面的解释。已有报告显示HIV-1成熟前后CA会发生结构的变化，但是诱导该结构变化的影响尚不明去。经过我们的研究，我们发现衣壳蛋白的碳端结构域（CAC）中的C198和C218之间能够被不可逆的氧化，形成二硫键。利用核磁共振方法，我们发现二硫键的形成未对CAC的三级结构造成影响，但是导致CAC二聚体的四级结构发生了，而这种四级结构的变化很有可能就是导致衣壳形状变化的重要诱因之一。在项目实施期间，我们发现CAC二聚体的作用界面由于交换问题倒是该区域核磁共振信号弱，应对该问题我们开发了一套能够用于采集分子间的顺磁探针，并且使用该套探针成功解析了弱相互作用的蛋白质复合体。另一方面，我们在项目执行期间，平行展开了磷酸化对泛素动态结构的调控的研究。研究结果显示磷酸化赋予了泛素对pH值的敏感性，溶液中pH值能够调控泛酸多种构象之间的比例。在本项目的资助下，我们共发表论文5篇，其中一篇发表在国际顶尖学术杂志PNAS上。申请并获得国家发明专利收取一项（专利号：201410061169）。