油菜BnWRKY33和75转录因子在菌核病抗性中的功能分析

Stem rot (Sclerotinia sclerotiorum) is a major disease in canola field. Generally, the attack ratio is about 10-30%, and yield loss can be up to 80% in severely infected fields. This disease limits the development of canola industry in China. S. sclerotinia is a kind of necrotrophic pathogen, and the fungi deploy two main pathogenicity determinants, the secretion of oxalic acid and hydrolytic enzymes. The host can activate the basal defence system by perception of chemical signals and shows some resistance to the fungi. Previous researches on the QTLs mapping in multiple environments and differential expression have identified that the BnWRKY transcription factors play an important role in resistance to the pathogen. Based on the previous researches, this proposal will show how the BnWRKY33 and 75 work after the fungi attacked. The results will help to improve the resistance of canola and develop canola industry.

菌核病是油菜生产的主要病害，一般发病率10～30%，严重时可达80%，严重影响了我国的油菜生产。菌核病是一种腐生性病害，病原菌通过分泌草酸和水解酶等侵染寄主，寄主通过对这些化学信号的识别，启动防御反应，表现出一定程度的抗性。基于多年QTL定位分析和接种前后基因表达差异展示，证明BnWRKY类转录因子在油菜菌核病发生中起着重要的作用。在此基础上，本研究将进一步明确BnWRKY33和BnWRKY75转录因子的诱导表达过程及其作用机理。在菌核病发生的过程中， BnWRKY33和BnWRKY75分别在菌核病发生过程中所扮演的角色；不同抗性材料的BnWRKY转录因子在抗病防御反应网络中的作用，同时过量表达2种转录因子的转基因单株和双突变体在核盘菌侵染后的表现。对于这些机理的研究，将有助于油菜菌核病的遗传改良，对我国的油菜生产具有重要的实践意义。

基于本室抑制性差减杂交的结果，分离到一个受到核盘菌诱导上调表达的基因 BnWRKY33，将其定位于A5 连锁群上；在Westar 材料中过表达 BnWRKY33可以提高核盘菌抗性，分析其启动子发现受到水杨酸及核盘菌的诱导；酵母单杂交筛选到 BnWRKY33 上游调控其转录水平的转录因子 BnWRKY15；利用 EMSA 和拟南芥原生质体瞬时表达验证了此互作，同时也发现BnWRKY33 与诱导区域的结合；转录激活检测及转录激活/抑制结构域作图发现 BnWRKY33 存在两个转录激活结构域， BnWRKY15 存在一个转录抑制结构域； BnWRKY15 在拟南芥原生质体中会降低 BnWRKY33 对自身的转录激活， 同时在 BnWRKY15 过表达植株中 BnWRKY33及其调控合成 camalexin 相关的基因都表现出表达量下降的情况，过表达植株的菌核病抗性初步鉴定也表现出抗性下降；利用转录激活和 EMSA 竞争性试验研究发现 BnWRKY15 对 BnWRKY33 对自身激活能力的影响机制可以归结为两个方面： 1.BnWRKY15抑制BnWRKY33 的转录激活能力；2. BnWRKY15 与BnWRKY33 一起竞争 WRKY33 启动子上的 W-box，而且 BnWRKY15 具有更强的 W-box 结合能力。受核盘菌诱导表达的 BnWRKY28 和BnWRKY40 也可以结合到 BnWRKY33 的启动子上，说明 BnWRKY33 在植物环境的刺激反应中可能处于调控路径的中心。.另一个受到核盘菌诱导表达的基因BnWRKY75为WRKY IId亚家族转录因子。接种核盘菌及喷施水杨酸后，BnWRKY75的表达量均有明显升高。BnWRKY75启动子分析也验证其受到核盘菌及水杨酸诱导； BnWRKY75在甘蓝型油菜中的过表达可提高对核盘菌抗性。为了解BnWRKY75介导的抗性机制，转基因植株及对照组RNA-seq测序筛选出4599个差异表达基因，其中2195个功能基因上调表达。.众所周知在高等植物中WRKY转录因子参与防御反应。但在油菜抗菌核病的调控中关于此类蛋白质的作用方式却又知之甚少。本研究不仅为研究油菜抗菌核病调控开拓了新的思路，也充实了抗菌核病调控网络。