人参皂苷Rg1对缺血缺氧神经元线粒体自噬的调控作用及机制

Studies have shown that mechanism of ginsenoside Rg1 to prevent cerebral ischemia-reperfusion injury is not clear.Our previous experiments showed that Rg1 could induce mitochondrial autophagy (Mitophagy) during transient cerebral ischemia and reperfusion,possibly through PINK1/Parkin, Nix/Bnip3 pathways.In order to further explore this mechanism, we intend to prepare oxygen glucose deprivation neurons and cerebral ischemia-reperfusion injury model,and detect the regulation effect of Rg1 on Mitophagy.On the basis of this, the glucose-deprivation model of PINK1,Nix silencing//overexpression(in vitro) and the model of ischemia-reperfusion (in vivo) were established to investigate the expression and activation of downstream factors of PINK1/Parkin, Nix/Bnip3 pathway after Rg1 intervention.In this study, we will discuss the regulation of Rg1 on Mitophagy from the molecular, cellular, tissue and animal whole level.This study will use Mitophagy as a new target for the prevention and treatment of ischemic stroke.

人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，但其作用机制尚不清楚。我们前期实验发现，Rg1能够诱导短暂脑缺血再灌注时的线粒体自噬（Mitophagy），可能是通过PINK1/Parkin、Nix/Bnip3等途径来发挥调控作用。为深入探讨这一机制，我们拟制备氧糖剥夺神经元和脑缺血再灌注损伤模型，采用Rg1进行干预后，检测Rg1对Mitophagy的调控作用；在此基础上，通过建立PINK1、Nix沉默//过表达细胞的氧糖剥夺模型（体外）及缺血再灌注模型（体内），探讨Rg1干预后PINK1/Parkin、Nix/Bnip3通路下游因子的表达及活化情况，从分子、细胞、组织、动物整体水平等探讨Rg1对缺血缺氧神经元Mitophagy的调控作用，明确Rg1通过调控Mitophagy发挥脑保护作用。本研究将从Mitophagy这一新靶点为缺血性卒中的防治提供新的靶点。

人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，但其作用机制尚不清楚。研究发现，于制备脑缺血再灌注模型前采用自噬抑制剂3-MA处理后，神经功能缺损、脑水肿、脑梗塞症状会更为明显，提示缺血前抑制基础自噬水平可能是有害因素。本课题中，我们采用Rg1预处理后造模，上述症状得到明显改善，电镜观察发现存在明显的自噬增强；而同时施加Rg1与3-MA后，自噬仍被抑制，症状未见明显缓解，提示3-MA可能抑制了Rg1对自噬的诱导作用。进一步提取脑组织顶叶皮质进行免疫印迹检测，发现Rg1预处理可诱导缺血再灌注后的LC3-Ⅱ和Beclin的表达水平。免疫荧光染色采用NeuN标记神经元，发现神经元的Beclin阳性率显著增多。提示Rg1的神经保护作用可能与增加Beclin-1的表达，诱导LC3-Ⅱ有关。而线粒体自噬是自噬中的最常见形式。我们采用JC-1法检测线粒体膜电位变化情况，发现Rg1能改善因脑缺血再灌注损伤后所引起的膜电位下降，从而改善线粒体功能。根据此结果，我们进一步提取脑组织线粒体，采用免疫印迹检测经典线粒体自噬通路PINK1/Parkin通路，发现缺血再灌注后PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ的水平显著增高，而经Rg1处理后，上述线粒体蛋白的表达水平进一步增高，而采用3-MA抑制后，上述蛋白质的水平显著降低。结合前期对于Rg1对于凋亡的研究，我们推测于缺血前使用Rg1预处理，可能通过提高基础状态的自噬水平，清除受损的线粒体，使细胞免受损伤，从而抑制细胞凋亡，减轻脑梗塞、脑水肿、神经功能缺损症状，发挥脑保护作用，其作用机制可能与Rg1抑制PINK1/Parkin通路有关。进一步我们拟采用基因沉默/过表达载体转染细胞，体外探讨Rg1通过PINK1/Parkin途径来发挥对Mitophagy的调控机制。但因人员变动较大等原因，影响了实验进度，第二年度任务未能如期完成，申请延长期限，继续完成实验。