血清循环miRNA表达谱用于早期肝癌诊断和复发的研究

前期，我们以筛查出31种差异miRNA为对象的主题分析可基本将肝癌组织与毗邻癌旁组织、正常肝组织分开。此外，还证实若干miRNA与肝癌的侵润及转移有关。提示肝癌组织miRNA表达谱可能有望成为新的肝癌标记物用于早期肝癌诊断。但选取肝癌组织检测技术复杂、创伤大。相对而言，外周血清容易获得和检测，便于临床应用和推广。新近研究显示通过检测血清中循环miRNA以诊断疾病是可行、稳定的。但目前关于肝癌演变过程中循环miRNA表达谱的研究尚未见报道。综上，我们设想通过检测乙肝-肝硬化-肝癌（早、晚期）中血清循环miRNA表达谱，建立一个以血清循环miRNA为基础的肝癌早期诊断、肝癌转移的分子预测模型，同时在肝癌的发生中进一步观察血清循环miRNA与传统的基因蛋白事件的相关性，进一步揭示血清循环miRNA作为早期肝癌诊断和复发的内在机理。该研究将对寻找肝癌早期诊断、早期预测的分子标志物提供新的线索与资料

本项目探讨血清miRNA在乙肝、肝硬化、乙肝相关肝癌和晚期乙肝相关肝癌中的表达谱差异，173种miRNA在肝癌进展中呈现差异表达，其中血清miR-145和miR-129-5p在癌组织中相对于在癌旁组织中下调表达最明显。.本项目进一步分析下调miR-145和miR-129-5p与乙肝相关肝癌临床病理资料间的关系，初步探讨其在乙肝相关肝癌发生发展过程中的作用及其临床意义。miR-145和miR-129-5p的表达在癌组织中比其癌旁组织明显下调。其中miR-145在肝癌组织中的表达与肝癌肿瘤大小、肿瘤分期、恶性程度、肝内外转移及血管侵犯有关但与患者性别、AFP均无关。其表达在肿瘤直径小于5cm、肿瘤分期高、分化程度低、有肝内转移及血管侵犯的肿瘤中更低。体内、外实验研究miR-145对肝癌细胞生物学功能的影响。将人工合成的pre-miR-145基因片段，克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中，构建重组质粒pIRES2-EGFP-pre-miR-145质粒。分别运用CCK8、流式细胞术和TransWell小室、细胞划痕试验检测过表达及去表达miR-145对肝癌细胞增殖、细胞周期和侵袭、迁移能力的影响。裸鼠皮下移植成瘤实验，观察过表达miR-145对肿瘤生长的影响。结果miR-145可抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，但对肝癌细胞周期无明显影响。荧光素酶报告实验证实miR-145靶向结合在ADAM17 基因 的3′UTR 。结果表明miR-145通过靶向调节ADAM17进而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭能力。.另外，为探讨miR-129-5p对肝癌细胞侵袭转移的影响及相关分子机制。分别转染以及共转染pre-miR-129-5p、anti-miR-129-5p、ETS1 siRNA后，观察细胞迁移和侵袭功能变化；构建含ETS1 3’UTR结合位点的荧光素酶报告载体,与miR-129-5p表达载体共转染,检测细胞中的荧光素酶活性；检测肝癌患者标本中miR-129-5p和ETS1的表达，结合临床资料进行统计学分析。miR-129-5p通过直接靶向作用于ETS1来抑制肝癌细胞的侵袭转移。本项目结果不仅揭示miR-145和miR-129-5p在肝癌中的的作用及其机制，而且将为肝癌的治疗新靶点提供科学依据和理论基础。