靶向G-四链体新型荧光原位杂交探针的设计合成及其在RNA结构与功能研究中的应用

RNAs adopt diverse folded structures that are essential for function and thus play critical roles in cellular biology. The G-quadruplex is one of the most important secondary structures that are formed by guanine-rich sequences. However, due to the lack of effective methods for detecting G-quadruplex structure formed by the appointed guanine-rich RNA sequence in cells, further investigation of RNA structure-function relationships was greatly restricted. Recently, we reported kinds of specific G-quadruplex probes. On this basis and enlightened by the fluorescence in situ hybridization (FISH) technique, we designed and synthesized a novel G-quadruplex-targeted fluorescence in situ hybridization (GT-FISH) probe targeting the NRAS mRNA 5′-UTR guanine-rich sequence. The key feature of such probe is the highly selectivity for both G-quadruplex structure and the forming sequence. Our pre-experiments also indicated that the GT-FISH probe could specifically detect the targeted G-quadruplex structures formed by the NRAS mRNA 5′-UTR guanine-rich sequences in cells. In this program, we will broaden the study and choose two guanine-rich sequences from mRNA and non-coding RNA as targets. We will design, synthesize and optimize the GT-FISH probes for these sequences. Then, we will discuss the design principles of GT-FISH probes based on the following mechanism studies. Furthermore, we will establish a visualization method based on the GT-FISH probes and explore its application in the study of the structure-function relationships of guanine-rich RNA sequences, striving to provide theoretical and technical support for the future RNA research.

RNA多样的生物学功能与其多变的拓扑结构密切相关，由富G序列形成的G-四链体是当中重要的功能性二级结构。由于缺少有效方法在细胞内对特定的RNA G-四链体进行示踪，以致后续结构与功能关系的研究受到极大限制。申请人基于前期发展的G-四链体探针并借鉴荧光原位杂交（FISH）技术，以NRAS mRNA 5′-UTR富G序列为靶标，设计合成了对序列和G-四链体结构均具有高识别能力的新型荧光原位杂交（GT-FISH）探针。实验结果表明，该探针在细胞内特异性对靶序列形成的G-四链体进行示踪。本项目将在此基础上拓宽研究面，从mRNA与非编码RNA中各选一段重要的富G序列作为研究对象，设计合成并优化相应的GT-FISH探针，通过作用机制研究阐明探针的设计原则，建立一套对目标RNA G-四链体进行示踪的可视化研究方法，挖掘这种新方法在RNA富G序列结构与功能研究中的应用，为今后同类型研究提供理论与技术支撑。

RNA多样的生物学功能与其多变的结构密切相关，由富G序列形成的G-四链体是当中重要的功能性二级结构。由于缺少有效方法在细胞内检测特定RNA形成的G-四链体，后续对他们进行研究受到极大限制。为此，本项目提出设计合成对序列和G-四链体均具有高识别能力的GT-FISH探针的研究设想。GT-FISH探针由靶向G-四链体的小分子荧光探针以及可以与富G序列相邻片段进行杂交的核酸分子两部分组成。针对前者我们基于先导化合物ISCH-oa1等结构构建了包含100余个新化合物的探针库，并且通过筛选发现了多个可以特异性检测不同G-四链体的小分子荧光探针。对于杂交核酸部分我们按指定目标富G序列的相邻片段合成不同长度及类型的核酸分子，并与筛选得到的小分子荧光探针共价偶联。经过以上系统的结构改造以及后续筛选优化，本项目成功发展了一系列能够特异性检测NRAS mRNA、APP mRNA以及c-MYC启动子等指定G-四链体的GT-FISH探针，建立了细胞内相应的可视化研究方法与体系，并进一步提出了GT-FISH探针的设计原则与使用规范。此外，我们应用GT-FISH等探针深入研究了NRAS、APP、c-MYC等重要G-四链体在不同细胞因素影响下的存在情况与行为，阐明了G-四链体与DHX36等结合蛋白相互作用对基因表达进行调控的分子机制。通过化学干预的手段配合可视化研究方法，我们还探究了G-四链体作为抗肿瘤药物新靶点的可行性。基于上述研究结果，本项目为研究G-四链体对基因表达进行调控的生物学功能和探讨G-四链体作为药物靶点的可行性提供了新策略和新依据。本项目研究内容按计划执行并已基本达到预期目标。已发表标注本项目资助包括ACIE在内与项目研究相关的SCI论文12篇，申请专利4项并获授权2项。执行期内培养博士生5名，硕士生4名。负责人获中国药学会-施维雅青年药物化学奖以及入选教育部国家级高层次青年人才。