特异性靶向RNA二级结构（G-四链体）的分子探针设计合成及其基因分子开关调控功能研究

RNA G-quadruplex is a special nucleic acid secondary structure formed by Hoogsteen hydrogen bonds from guanine-rich RNA sequences. This structure involves a series of important biological regulation processes that are associated with multiple diseases and it has been viewed as novel diagnostic and therapeutic target. Molecular probes that specific targeted RNA G-quadruplex have great potential in novel diagnostic reagents and drug discovery. However, since RNA G-quadruplex is structurally similar to DNA G-quadruplex and co-exists inside the cell, molecular probes of RNA G-quadruplex are strongly interfered with by DNA G- quadruplex, which greatly limit the application of the probe. The project aims to screen, design and synthesize a series of molecular probes that highly specific for RNA G-quadruplex and capable of efficiently recognizing RNA and DNA G-quadruplexes from the structural differences of RNA and DNA G-quadruplex. This projects also wants to explore the probe’s regulatory functions as a molecular gene switch and provides substantial basis and techniques to develop novel diagnostic reagent and drugs targeting RNA G-quadruplex.

RNA G-四链体是由富含鸟嘌呤的RNA序列通过Hoogsteen氢键形成的一种特殊的核酸二级结构，该结构牵涉到一系列重要的生命调控过程，与多种疾病的发生发展密切相关，是一类潜在的新型疾病检测及治疗靶点。特异性靶向RNA G-四链体的分子探针在新型诊断试剂及药物发现方面具有较大潜力。但是，由于RNA与DNA G-四链体的结构极为相似且共同存在于细胞内部，DNA G-四链体会对RNA G-四链体的分子探针产生强烈干扰，因而极大的限制了探针的应用。本项目计划针对RNA和DNA G-四链体结构差异性开展深入研究，筛选、设计、合成一系列能够有效分辨RNA与DNA G-四链体的高特异性RNA G-四链体分子探针，并对探针的基因分子开关调控功能进行探索，为建立靶向RNA G-四链体的疾病检测试剂及治疗药物奠定坚实的理论及技术基础。

本项目研究确证了RNA G-四链体与DNA G-四链体结构上的微小差异性。本项目研究发现，RNA G-四链体与DNA G-四链体结构具有差异性的部分主要体现在碱基与核糖的空间取向有一定差异，这也是导致RNA G-四链体更倾向于形成平行结构四链体的原因；RNA中核糖2ˊ-羟基与DNA 中脱氧核糖2ˊ-氢原子的不同导致的配体分子氢键识别的差异性。本项目开展了精确辨识RNA 和DNA G-四链体结构、具有高度专一性的RNA G-四链体配体分子筛选、设计、合成及结构优化。基于RNA G-四链体结构特征，开展了特异性靶向RNA G-四链体结构的有机分子探针的筛选。我们筛选了包含人工有机合成分子如花菁染料类分子、卟啉类分子、硫磺素T及其衍生物、PDS(pyridostatin)类分子等，以及一系列天然产物分子。针对一系列有机分子，利用荧光测定的方法，分别测定了上述一系列分子与RNA G-四链体、DNA G-四链体、非G-四链体RNA、非G-四链体DNA的相互作用。筛选过程中，绝大多数对RNA G-四链体有荧光响应识别效应的有机分子探针同样对DNA G-四链体也有荧光识别响应。随着筛选不断推进，最终在天然产物化合物中，筛选得到一种含有多个羟基的2-苯基色原酮类分子杨梅素，其对RNA G-四链体具有显著的荧光响应，而对DNA G-四链体、非G-四链体RNA以及非G-四链体DNA均无显著荧光响应。进一步对系列2-苯基色原酮类分子与RNA G-四链体的相互作用进行深入研究，发现其3个特定位点羟基取代基对于RNA G-四链体的识别至关重要，提出该类化合物作为RNA G-四链体探针的基本母核结构；进一步通过RNA/DNA混合碱基突变合成方式证明2-苯基色原酮类分子探针识别位点为RNA G-四链体中的核心G-tetrad结构，而不是侧链结构。本项目发现的新型高特异性RNA G-四链体分子探针为实现生物体系中特异性的RNA G-四链体的识别与调控提供了新的有效的手段。