伊玛替尼治疗胃肠道间质瘤耐药相关microRNA的研究

临床观察到小分子酪氨酸激酶抑制剂伊玛替尼能有效控制约80%转移/复发性恶性GIST，但2年左右约50%患者发生继发耐药。详细机制需进一步研究。我们前期的工作通过Agilent芯片技术进行全基因组miRNA差异表达分析，已筛选出3个耐药GIST与原发GIST显著差异表达的miRNA分子标志物。本研究拟通过荧光定量RT-PCR方法，对这些miRNA于50例耐药和原发GIST中进行验证。利用TargetScan等生物数据库和降解组测序法，查找这些miRNA与GIST耐药发生可能相关的靶基因，通过与转染实验相结合的Western Blot、酶谱法和荧光素酶活性检测鉴定靶基因，从miRNA水平探讨耐药机制，促进对分子靶向治疗耐药机制的深入认识，为逆转耐药提供理论依据。

实验背景：本课题组主要研究耐伊玛替尼GIST和miRNA的关系以及耐伊玛替尼GIST中miR-518a-5p 对PIK3C2A的作用。.实验方法和结果：本课题组选择了7对配对标本,即耐药组和原发组标本均为同一患者的耐药前后手术切除GIST标本，进行基因芯片筛选，筛选出耐药组和原发组差异表达最显著的miRNA其中上调的包括hsa-miR-1260b、hsa-miR-2964a-5p、hsa-miR-3907和hsa-miR-491-3p，下调的包括hsa-miR-518a-5p/hsa-miR-527、hsa-miR-4466、hsa-miR-595、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-3655。通过real-time PCR对另外13对配对标本验证，发现hsa-miR-518a-5p在耐药组中明显下调(P = 0.011)。然后我们从多个生物数据库筛选到靶基因PIK3C2A，在耐伊玛替尼GIST882R细胞中进行PIK3C2A的3’UTR luciferase ，验证了miR-518a-5p和PIK3C2A的直接作用关系。随后我们在882R细胞中建立了miR-518a-5p过表达及敲低细胞系，real-time PCR证实在882R miR-518a-5p过表达和敲低细胞系中，miR-518a-5p的表达分别实现了上调和下调，Western blot检测证实miR-518a-5p过表达细胞系中PIK3C2A的表达下降较为明显。最后我们利用CCK8法在过表达和敲低细胞系中检测细胞IC50的变化，miR-518a-5p的过表达降低了细胞的IC50；敲低miR-518a-5p则增加细胞的IC50；采用TUNEL 法在过表达和敲低细胞系中检测细胞凋亡的变化 ，miR-518a-5p的过表达增加了细胞的凋亡；敲低miR-518a-5p则降低细胞的凋亡。.实验结论：有报道称PIK3C2A促进肿瘤的存活，因此，miR-518a-5p在耐药GIST中表达下降极可能通过上调PIK3C2A，影响细胞对药物的反应，引起耐药。.课题成果：本课题组已发表多篇论著，其中SCI收录3篇，国内核心期刊收录5篇。本课题组还发明了8项专利，均已授权，其中专利的高产组织芯片技术将用于本课题后续的实验研究。本课题共培养研究生2名，其中毕业1名，在读1名。