Rac GTPase 调控视网膜色素上皮细胞间质样转分化作用及机制研究

基础和临床研究均已证明，在增生性玻璃体视网膜病变（PVR）过程中，视网膜色素上皮(RPE)细胞发生形态和生物学功能的改变，由上皮细胞表型向间质样细胞表型转分化，但其确切机制仍不清楚。研究发现，Rac1 GTPase参与调控多种细胞行为和分化，是否也调控视网膜色素上皮细胞间质样转分化？我们设想，Rac1 GTPase可能通过调控RPE细胞间质样转分化来影响PVR的发生与发展。本项目拟采用细胞免疫荧光、Real time PCR、Western blot及腺病毒转染表达等技术进行以下研究：获取Rac1 GTPase参与RPE细胞间质样转分化过程的证据；证实Rac1 GTPase调控人视网膜色素上皮间质样转分化的作用并阐明其机制；建立PVR动物模型，评价抗Rac防治PVR形成的效果。本项目将为PVR的发病机制提出新的理论，为确立Rac1GTPase作为防治PVR的新靶点提供充足的科学依据。

目的：观察人玻璃体液体外培养诱导人视网膜色素上皮(RPE)细胞间质转分化作用，探讨其分子信号机制。方法：将3～5代传代人RPE细胞分为普通培养组和玻璃体液培养组，分别应用普通培养液和25％玻璃体液进行培养。采用相差显微镜观察两组细胞形态变化，细胞爬片检测肌动蛋白细胞骨架的变化。分别用细胞划痕法、Transwel小室侵袭法及I型胶原凝胶收缩实验检测细胞迁移、侵袭及收缩力的变化。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测r平滑肌肌动蛋白(mSMA)和Snaill tuRNA的表达。应用免疫荧光技术检测细胞骨架蛋白F-actin、α-SMA和vinculin的定位染色，应用免疫印迹技术检测α-SMA和vinculin蛋白的表达。结果：相差显微镜观察发现，普通培养组细胞保持扁平形态，细胞接触广泛；玻璃体液培养组细胞一端呈扇形，另一端呈锥形拖尾形或梭形，细胞生长呈彼此分离的方式。细胞爬片结果显示，普通培养组肌动蛋白骨架主要分布于RPE细胞周边部，形如细胞周边的条带状；玻璃体液培养组肌动蛋白纤维在细胞的一端重排，形成扇形扁平状伪足突起，而在细胞另一端形成锥形拖尾改变。玻璃体液培养组与普通培养组比较，RPE迁移及侵袭能力显著增强、细胞收缩能力显著下降，差异均有统计学意义。RT-PCR检测结果显示，玻璃体液培养组与普通培养组比较，Snaill mRNA表达显著上升，a-SMA mRNA表达显著下降，差异均有统计学意义。与普通培养液培养相比，低传代的人视网膜色素上皮细胞玻璃体中培养48 h，胶原凝胶面积明显大于在普通培养液中的凝胶面积，细胞收缩能力显著下降，两组比较差异有统计学意义。在普通培养液中，Factin、vinculin主要分布于细胞周边，vinculin形成的粘连斑粗大; 而在玻璃体中培养后，Factin重组，在细胞的一端形成扁平伪足结构，vinculin主要分布于细胞扁平伪足端和细胞中央，形成的粘连斑明显变小。玻璃体培养后α-SMA蛋白表达显著下降，与普通培养液相比差异有统计学意义; vinculin蛋白表达无显著变化。结论：玻璃体液培养可诱导RPE细胞间质转分化，并可导致RPE细胞收缩性下降。这一作用通过增强RPE细胞迁移及侵袭能力，抑制RPE细胞收缩力；提高RPE细胞Snaill mRNA表达，下调a-SMA mRNA、蛋白表达实现，且与vinculin重新分布有关。