Tgfβ3通过PAR/aPKC蛋白调节腭中嵴上皮细胞极性影响腭发育的基础和应用研究

腭中嵴上皮细胞形态的改变，表面丝状伪足的形成与消失伴随着腭发育，与腭裂的形成有着密切的关系，尽管国内外学者曾观察到腭裂形成中的这一共性现象，但尚未对内在的机制进行深入的了解。更缺乏以此为突破口，探索逆转腭裂发生的尝试。本研究基于丝状伪足为上皮细胞极性结构这一特征和前期的研究结果，提出从细胞极性的内在机制和调控机理入手，利用RNAi，荧光原位杂交，连续超微切片三维重建和分子生物学技术从细胞，器官，母体环境不同层面，多个角度，观察腭中嵴上皮细胞极性，丝状伪足与腭发育的关系，通过检测PAR/aPKC的时空表达改变来探讨可能的内在分子机制，同时利用超声引导羊膜注射技术外源性引入Tgf β3尝试逆转二恶英诱导的腭裂模型中，腭中嵴上皮细胞极性丧失的现象，恢复细胞的功能，重启腭的发育为腭裂预防性治疗探索新的手段。

细胞极性是细胞发挥许多功能的基础和必须条件，目前越来越多的研究显示PAR极性复合体对于上皮细胞极性的建立和维持起重要的作用。本研究从上皮细胞极性的内在调控机制入手，旨在探讨：1）地塞米松是否可以影响腭中嵴上皮细胞PAR极性复合体基因的表达，并进一步扰乱其细胞极性而影响腭融合；2）初步研究体外环境下TGF-β3是否可以通过调节PAR极性复合体而影响腭胚突的发育；3）探讨细胞凋亡及上皮-间充质转化在体内腭融合过程腭中嵴上皮消失中的作用。课题通过系统研究，发现：1)、应用地塞米松腹腔注射后，腭裂发生率（46.15%）明显高于对照组腭裂发生率（3.92%），二者的差异具有统计学意义（χ2=24.335，P=0.00<0.01）。2)、与正常的腭胚突相比，地塞米松致畸后可以导致腭胚突的发育延迟，并出现短小的腭胚突，而且可以导致腭中嵴上皮的形态及排列改变，使其由极性排列的双层结构变为非极性排列的单层排列。此外，腭胚突表面的球状结构及丝状伪足的形成减少，从而导致腭裂。3)、在腭胚突的发育过程中，PAR3和PAR6蛋白仅在腭上皮中表达，aPKC则表达于腭上皮和腭间充质中。4)、地塞米松可以在蛋白和基因水平下调PAR3/PAR6/aPKC的表达。5)、我们通过差速贴壁和差速消化方法获得细胞，此细胞表达Pan-cytokeratin和E-cadherin，而不表达Fibronectin和Vimentin。6)、应用TGF-β3基因RNAi慢病毒体外转染腭胚突72h后导致MES退化消失的障碍，导致腭融合的失败，而TGF-β3基因过表达后则可以促进腭胚突的融合。7)、应用免疫组织化学和TUNEL法检测发现腭融合的关键阶段（E14.5）MES上皮中出现纤连蛋白和波形蛋白的表达，并同时出现细胞凋亡，且前中后腭部MEE细胞均出现细胞凋亡，中后部的细胞凋亡率明显高于前部。8)、地塞米松可以从蛋白和基因水平下调E-cadherin/β-catenin复合体表达，从而导致腭裂。综上所述，地塞米松可以导致腭胚突的生长发育延迟，并造成PAR极性复合体在蛋白和基因水平的表达下降，从而影响MEE细胞的极性丧失导致腭裂。在体内腭胚突融合的关键阶段，EMT过程和细胞凋亡均参与了MES的退化消失，且前中后腭部的融合机制基本一致。此外，TGF-β3基因可能通过PAR极性复合体调节腭胚突的发育。