噬菌体MmP1早期基因的鉴定及其在寄生宿主中作用研究

噬菌体是感染细菌的病毒，有望作为临床耐药菌感染的治疗剂而具有重要研究价值。噬菌体侵入敏感宿主后，早期即可表达一些基因，能迅速控制宿主菌生长，为其自身的复制创造适宜环境。因此噬菌体关闭宿主代谢功能的基因常常是一些早期基因，但噬菌体极富多样性,目前对噬菌体早期基因的认识还非常有限。MmP1是我室分离的一株耐药摩氏摩根菌噬菌体，全基因组测序证实其为T7家族新成员，预测的早期基因有12个，9个功能未知。本项目拟用RT-PCR方法鉴定MmP1早期基因表达，根据实验分析选择其中4个分别构建诱饵质粒，与宿主基因组表达文库进行细菌双杂交，从宿主全基因组水平筛选与MmP1早期蛋白相互作用分子，进行测序和信息学分析，再对宿主菌中的靶基因分别实施敲除，构建突变菌株，观察其对MmP1感染的影响，从噬菌体早期基因与宿主功能基因相互作用角度探讨MmP1寄生宿主菌的机制，为筛选新的摩氏摩根菌治疗剂提供靶点和依据。

噬菌体是感染细菌的病毒，侵入敏感宿主后，早期即可表达一些基因，能迅速控制宿主菌生长，为其自身的复制创造适宜环境。噬菌体关闭宿主代谢功能的基因常常是一些早期基因，但噬菌体极富多样性,目前对噬菌体早期基因的认识还非常有限。噬菌体MmP1是我室自行分离的一株新噬菌体，全基因组测序证实其为T7家族新成员。预测的早期基因有12个，9个功能未知。本项目首先用qRT-PCR方法证实早期推定基因的表达，其中效果较为理想的是g2、g3、g5、g6、g8、g10和g11基因7个基因。接着，将噬菌体MmP1早期推定基因克隆到细菌双杂交系统的pBR质粒表达载体上，转化DH5α大肠埃希菌，挑选氯霉素（Cm）抗性菌落，提取质粒进行测序分析，获得序列正确的诱饵质粒。然后提取宿主菌CQSW20全基因组DNA，用Sau3AI进行部分酶切，回收0.5-1.5kb片段，克隆至pRAC表达质粒，电转化DH5α大肠埃希菌，构建宿主菌基因组文库。采用细菌双杂交（B2H）系统对噬菌体MmP1早期推定基因和宿主菌基因组文库进行初筛，目前尚未获得理想结果。项目组对实验内容作了必要的调整。由于宿主菌CQSW20背景对项目实验展开至关重要，试剂盒提取宿主菌CQSW20基因组DNA送军科五所进行了全基因组测序，序列拼接全长约4.6Mb，包含超过4500个基因，基因组分析其为大肠埃希菌K-12菌群。针对细菌双杂交实验效果不佳,项目组对噬菌体MmP1和宿主菌CQSW20进行了RNAseq转录组测序分析。通过在细菌对数生长早期加入噬菌体MmP1，观察噬菌体MmP1在繁殖早期不同时间段噬菌体和宿主菌的基因转录情况，分析噬菌体早期基因对细菌生长的影响，探讨其寄生机制。而且，宿主菌CQSW20株全基因组测序和噬菌体MmP1与宿主菌转录组测序的完成，有助于设计特异性的表达文库，为探索细菌双杂交实验提供了针对性，从而为探讨噬菌体MmP1和其寄生宿主相互作用机制，筛选新的宿主菌治疗剂提供靶点奠定一定基础。目前项目组发表相关技术文章2篇，培养博士后1名。