靶向胱硫醚γ-裂解酶抑制剂的发现及作用机制研究

Identifying potent and selective lead compounds for drug targets from chemical libraries remains a key element of modern drug discovery. Cystathionine γ-lyase (CSE) is one of the three critical enzymes involved in the synthesis of hydrogen sulfide (H2S), and play important roles in various physiological processes and diseases. Therefore, it has been considered to be a potential target for drug design and discovery. However, the low potency and selectivity of known inhibitors for CSE limited their scientific and clinical application. Base on our newly designed hydrogen sulfide detection assay, we are planning to construct a high-throughput screening assay for CSE inhibitors and search for new inhibitors with high selectivity and potency by screening several chemical libraries, including National Cancer Institute (NCI) chemical libraries, natural product library, etc. Next, we will study the mechanism of action of CSE inhibitors using drug design and site-directed mutagenesis techniques. Furthermore, we will also test the effect of the new inhibitors in cells. This research will provide new research tools for the structure-function studies of the CSE enzyme and also potential drug leads for the CSE-related diseases.

药物筛选是发现疾病靶标高效先导化合物的重要途径之一。胱硫醚γ-裂解酶（CSE）是气体信号分子硫化氢合成的关键酶之一，其具有重要的生理功能，并且与多种疾病的发生相关，因此是新型的药物靶点。但是，CSE已知的抑制剂活性低、选择性差，不利于其在科学研究和临床中的应用。本项目拟基于我们新构建的硫化氢检测模型，建立靶向CSE抑制剂的高通量筛选方法，并通过药物筛选从美国国立癌症研究所（NCI）化合物库、天然产物库等化合物库中，获得靶向CSE的高效、高选择性的抑制剂; 结合药物设计和定点突变等技术手段，阐明新型抑制剂调控CSE的分子机制; 通过细胞实验，研究抑制剂在细胞水平的有效性和生物学效应。本项目的研究成果将为胱硫醚γ-裂解酶的结构-功能关系研究提供研究工具，同时为CSE相关疾病的药物研究奠定基础。

胱硫醚γ-裂解酶（CSE）是气体信号分子硫化氢合成的关键酶之一，其具有重要的生理功能，并且与多种疾病的发生相关，因此是新型的药物靶点。但是，CSE已知的抑制剂活性低、选择性差，不利于其在科学研究和临床中的应用。本项目建立胱硫醚γ-裂解酶的小分子抑制剂的筛选平台，并基于此发现靶向 CSE 的抑制剂。我们基于192串联双孔板的胱硫醚γ-裂解酶的小分子抑制剂高通量筛选平台的建立，并对其进行优化。随后，从美国国立癌症研究所化合物库、美国联邦食品药品监督管理局批准的药物库、商品化的Maybridge化合物库等化合物库和天然产物库共11954种化合物进行了筛选，发现了30个对CSE酶的半数抑制浓度IC50值在50 μM以内的抑制剂。其中，NSC4056的抑制活性最好（IC50 = 0.6 μM），并且对另外两种维生素B6依赖性酶胱硫醚β-合酶和多巴脱羧酶表现出选择性。通过硫化氢吸收实验、去垢剂干扰实验、质谱、反应活性氧检测和亚甲基蓝实验，我们证实NSC4056确实是CSE酶的抑制剂，而不是“假阳性”的抑制剂。通过稀释法，我们发现是NSC4056是靶向CSE的非共价抑制剂。通过等温滴定实验，我们证实了NSC4056能够直接结合在CSE酶上，且结合比率为1：1。通过酶动力学实验，我们发现NSC4056是通过竞争底物L-Cys的结合位点从而抑制CSE酶活力。通过分子对接，我们发现CSE酶Arg62, Tyr114和Arg119与NSC4056的羧基氧存在着氢键作用，并通过定点突变和合成、购买获得的NSC4056结构类似物的酶活实验加以验证。通过硫化氢影像、醋酸铅试纸和质谱，我们证实NSC4056能够抑制巨噬细胞Raw264.7内源性CSE产生的硫化氢气体,且活性优于已知抑制剂PAG。通过构建CSE突变体及CBS过表达的HEK293T 细胞系，我们证实了NSC4056在细胞水平能够选择性抑制CSE酶的活力。在失血性休克大鼠模型中，NSC4056能够有效抑制硫化氢的升高，并且缓解大鼠的低血压症状，证明了其在动物水平的有效性。该项目的完成为CSE酶的功能研究提供工具，为相关疾病治疗提供先导化合物。