马氏珠母贝α2-巨球蛋白基因分子特征及其促噬菌功能分析

α2-macroglobulin (α2M）, a kind of universal macromolecular protease inhibitors, which is considered to play an important role in both invertebrate and vertebrate innate immunity through the protease inhibition activity. While as a member of thioester-containing proteins (TEPs) superfamily, whether mollusc α2Ms act as a kind of complement-like opsonin engaging in the innate immune system like insects TEPs or not still remains unclear. Based on the known EST of α2M from Pinctada fucata, molecular characteristics and function in promoting phagocytosis of α2M will be studied in this work, including to analyze the primary sequence structure and phylogenetic relationship of members in TEPs superfamily, demonstrate tissue distribution, subcellular localization and the expression profile，and finally, to explore the function in phagocytosis and its molecular mechanism and add substantial evidence of the complement-like function for mollusc α2Ms through dsRNA interference and methylamine treatment. This work will provide a scientific basis for further study on the innate immune system of Pinctada fucata.

α2-巨球蛋白（α2-macroglobulin, α2M）是一种广谱蛋白酶抑制因子，目前普遍认为其通过蛋白酶抑制活性在动物先天免疫过程中发挥重要作用。而作为含硫酯蛋白超家族的主要成员，贝类α2M是否类似于昆虫含硫酯蛋白（TEPs）通过发挥补体样调理素活性参与机体的先天性免疫反应尚不明确。为此，本项目将在获得马氏珠母贝α2M基因部分序列的基础上，开展其分子特征及促噬菌功能的分析研究。分析α2M序列结构特征及含硫酯蛋白超家族成员的分子进化关系；明确α2M的组织分布、亚细胞定位及转录表达模式；研究α2M基因沉默及失活处理对血细胞噬菌作用的影响，探索α2M的促噬菌功能及其分子机制，获得贝类α2M具有补体样调理素活性的可靠证据。项目研究以期为进一步阐明马氏珠母贝非特异性免疫防御的分子机制提供依据。

α2-巨球蛋白（α2M）作为广谱蛋白酶抑制因子在动物先天免疫过程中发挥重要作用。但其同时作为含硫酯蛋白超家族的主要成员，贝类α2M是否类似于昆虫含硫酯键蛋白通过发挥补体样调理素活性参与机体的先天性免疫反应尚不明确。为此，本项目开展了马氏珠母贝α2M基因（Pfα2M）分子特征及促噬菌功能的分析研究。分析了α2M序列结构特征及含硫酯蛋白超家族成员的分子进化关系；明确了α2M的组织分布和转录表达模式；研究了α2M基因沉默及失活处理对血细胞噬菌作用的影响，以探索其促噬菌功能及分子机制，获得贝类α2M具有补体样调理素活性的可靠证据。研究结果表明，Pfα2M基因cDNA序列全长6598bp，其中5' UTR 30bp, 3' UTR 619bp，开放阅读框5949bp，编码1982个氨基酸，其分子量计算值为223.1kDa, 理论等电点为6.06。生物信息学分析表明，Pfα2M含有19个氨基酸残基组成的信号肽序列以及诱饵区、内部硫酯键和受体结合区3个功能区；多重比对研究发现，贝类α2M均具有典型的硫酯键结构GCGEQ，且受体结合区同源性要显著高于诱饵区；系统进化分析显示，马氏珠母贝与栉孔扇贝α2M序列聚为一支，亲缘关系最近；而α2M与人类补体序列分为2个不同的进化分支。Pfα2M在马氏珠母贝各检测组织中均有表达，但血淋巴和消化腺中的表达水平显著高于其它组织；溶藻弧菌感染2h后，血细胞中Pfα2M表达水平显著升高；感染4h后，血细胞中Pfα2M含量相对下降，而其它检测组织中Pfα2M含量均有不同程度的升高。体外及体内吞噬试验表明，dsRNA干扰及甲胺失活处理后均显著降低马氏珠母贝血细胞的吞噬活性，证明Pfα2M参与了血细胞的细菌吞噬活动，并在其中发挥了重要作用。此外，项目执行期间课题组应用Illumina/Hiseq-2000 RNA-Seq测序技术对溶藻弧菌感染前后马氏珠母贝血细胞转录组进行了对比分析，获得了大量参与免疫防御与调控的unigene，并对其免疫防御与调控网络进行了分析。.综上，项目研究不仅明确了马氏珠母贝α2M的序列结构特征、家族分子进化关系、组织分布和转录表达模式，而且证实了α2M在细菌吞噬活性中的重要作用，获得了贝类α2M具有补体样调理素活性的实验证据；项目研究结果为进一步阐明马氏珠母贝非特异性免疫防御的分子机制提供了理论资料。