小鼠1号染色体新印记基因的鉴定及差异甲基化区分析

印记基因对哺乳动物胚胎发育和出生后的生长具有重要的调节作用，包括肿瘤在内的许多疾病与印记基因的异常表达有关。因此，对基因组印记展开研究，无论是对于发育和表观遗传学领域基础理论的发展，还是对于有关疾病的诊断与治疗都具有重要意义。基因组印记研究的首要任务是鉴定新的印记基因并解析其表达调控机制。因此，本项目根据印记基因成簇分布的特点，将小鼠1号染色体的Zdbf2-Gpr1印记区上下游各1Mb区域内的所有基因和EST作为侯选印记基因，利用基于SNP标记的RT-PCR产物直接测序法对这些基因和EST进行印记分析，以期鉴定新的印记基因或印记基因簇，为小鼠印记基因家族增加新成员。同时，利用亚硫酸氢盐直接测序法，对该区域内的12个CpG 岛进行甲基化分析，以期鉴定新的差异甲基化区(DMR)，为这些印记基因的表达调控研究奠定基础。

本项目完全按照预定实验计划实施，并取得以下三方面的成果。 . (1). 本项目根据印记基因成簇分布的特点，利用基于SNP标记的RT-PCR直接测序法，在小鼠整个发育阶段和广泛的组织类型中对Zdbf2-Gpr1印记区内的24个基因和6个EST进行印记鉴定。结果表明，Adam23基因及EST- CJ051953是组织及发育阶段特异性的印记基因。同时，我们利用原位杂交技术对新鉴定的EST-CJ051953进行了表达分析，发现该印记的EST主要在神经系统中高表达，提示该EST的功能可能与神经系统的发育有关。我们的实验结果为印记基因家族增加了新成员，同时为新印记基因基因后续的功能研究提供依据。. (2). 印记基因的表达一般受差异甲基化区（DMR）调控。因此检测DMR是揭示印记基因甚至整个印记基因簇印记表达机制的首要任务。本项目利用亚硫酸氢盐直接测序法，对小鼠Zdbf2-Gpr1印记区内的CpG岛进行了甲基化分析，结果在邻近Zdbf2基因上游鉴定了一个新的父本特异甲基化的DMR，为该印记区后续的表达调控机制研究奠定了基础。. (3). 5-羟甲基化胞嘧啶(5hmC)是由5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化而来，是一种新的表观遗传学修饰，在基因的表达调控中发挥重要的作用，被称之为哺乳动物DNA 第六种碱基。氧化亚硫酸氢盐测序法（oxBS-Seq）是一种新兴的在单碱基分辨率上检测5hmC的方法。目前，利用该方法检测特定基因区域5hmC的研究还未见报道。因此，我们利用oxBS-Seq法检测了两类小鼠DMR(父本甲基化的Z-DMR和母本甲基化的Gpr1-DMR)的5hmC位点。结果表明，在两类DMR中共存在12个5hmC位点。这些结果表明了利用oxBS-Seq法检测特定区域内单碱基5hmC的有效性，同时为后续5hmC与基因转录活性之间的因果关系的研究提供了依据。