牛卵巢卵泡颗粒细胞CART相互作用蛋白的研究

在可卡因苯丙胺调节的转录肽（Cocaine- and Amphetamine-Regulated Transcript,CART ）对牛、绵羊卵巢卵泡发育起局部负调控作用研究的基础上，进一步假设如果阻断与CART结合的、使CART发挥作用的相关蛋白途径，单胎动物一次发情周期中就会有多个卵子排出。许多学者围绕CART相互作用蛋白进行了大量的试验研究工作，尽管还未找到与CART相互作用的蛋白，但找到了与CART相互作用的未知蛋白的DNA序列，并发现了CART在细胞系的结合位点，都为我们进一步克隆和筛选CART相互作用蛋白提供了非常重要的科学思路。本研究旨在利用同期发情、B超监测和监控牛卵巢卵泡发育、文库构建、转录组深度测序和生物信息学等现代生物技术研究牛卵巢卵泡颗粒细胞CART相互作用蛋白，阐明CART与其相互作用蛋白的互作关系，为进一步探明单胎动物在一次发情周期中只排一个卵子的研究奠定。

单胎动物卵母细胞来源制约胚胎工程迅速发展。家畜繁殖过程仅少数卵母细胞完成受精并产生后代。然而，大于99%卵泡在发生过程中闭锁而不排卵,一次发情周期只有一个卵泡发育成熟排卵。即使多胎动物也只有部分卵泡发育成熟，其他在不同发育阶段先后退化。因此，解决卵巢卵泡闭锁，提高成熟卵泡排卵数，对畜牧业快速发展及胚胎生物技术实施具有重要意义。本研究采集牛发情周期第一卵泡波不同发育时间点的4组卵泡PDF1、PDF2 (偏离期前最大和次大卵泡，发育速率相同)和ODF1、ODF2 (偏离期最大和次大卵泡，发育速率差异)的颗粒细胞转录组（High-seq）测序，筛选高差异表达基因；免疫共沉淀及LC-ESI-Q-TOF质谱分析鉴定蛋白组分111个；Cytoscape V3.1.0构建CART相互作用蛋白网络图；通过多项生物信息学技术，从1331个高差异表达基因和111个质谱分析蛋白筛选195个膜蛋白，包含38个G蛋白偶联受体；用SWISS-MODEL和MODELLER同源建模对CART和38个G蛋白偶联受体进行分子建模；经ZDOCK V3.0.2分析，将CART分别与38个G蛋白偶联受体逐一进行分子对接，通过静电能量、几何匹配运算求卷积法求解，FFT法加速，用基于几何匹配PSC（Pairwise Shape Complementarity）和原子配对统计打分ACE（Atomic Contact Energy）评价，鉴定AGTR2、CMKLR1和TEDDM1为CART相互作用蛋白（CART候选受体）；通过Real-time PCR和West bolt从mRNA和蛋白水平对AGTR2、CMKLR1和TEDDM1在牛卵泡颗粒细胞表达分析，完成基因全长序列测定及组织蛋白表达。该课题为研究单胎家畜卵泡闭锁提供依据，为提高单胎家畜排卵率，解决优种扩繁等提供技术支持；为明确CART受体以及用X射线晶体衍射或核磁共振波谱技术获得CART及受体蛋白复合体在溶液中三维结构、分析其动态变化过程奠定基础；为研究CART与相关蛋白调控机制以及完善CART在卵泡颗粒细胞信号转导的分子作用机制、探明CART及其相互作用蛋白网络图谱和其在复杂蛋白体系形成及功能发挥过程关键作用提供依据，有助于揭示人类相关疾病发生发展过程，对新药研制和治疗人类疾病具有重大意义，有望为糖尿病治疗提供新思路，同时形成一条研究神经肽受体成熟通路。